治療肺部囊性纖維化的黏液穿透型納米基因載體的研究進(jìn)展

方嘉宜，羅沛力，曾竟軒，裴慶澳，王文浩，黃鄭煒，黃瑩，潘昕，吳傳斌,

（1.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510032；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006）

囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是由編碼跨膜導(dǎo)管調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）蛋白的基因突變所引發(fā)的遺傳性疾病，在高加索人中很常見(jiàn)，每2 500例活產(chǎn)中就有1例[1?2]。用于CF的治療手段包括體位引流、抗生素聯(lián)合祛痰藥物和基因療法等。而基因療法因能從根源上治療疾病而具有極大的應(yīng)用前景[1]。

在基因療法中，通過(guò)肺部吸入將基因藥物原位遞送至肺部病變部位是治療CF的有效手段。但是，CF患者氣道分泌物的液體和電解質(zhì)成分發(fā)生改變，使患者肺部的黏液理化性質(zhì)發(fā)生病理性變化。這種變化使肺部吸入后的基因藥物比正常狀況下更難穿透黏液到達(dá)病灶部位，使其生物利用度大幅降低，嚴(yán)重制約著肺部吸入基因藥物的治療效果。

因此，設(shè)計(jì)一種能有效地通過(guò)病變黏液到達(dá)病灶部位的藥物制劑成為了CF治療中的研究熱點(diǎn)。納米科學(xué)的迅速發(fā)展，為藥劑學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了黏液穿透型納米基因載體。理想的黏液穿透型納米基因載體能快速穿透黏液層并在病灶區(qū)域釋放藥物，有效改善CF的預(yù)后。

本文對(duì)肺部黏液的組成特征、CF患者肺部黏液的病理變化和黏液穿透性納米基因載體的設(shè)計(jì)策略及穿透效果表征方式進(jìn)行了綜述，為用于治療肺部囊性纖維化的黏液穿透性納米基因載體的后續(xù)研究及促進(jìn)肺部囊性纖維化基因治療的臨床應(yīng)用提供參考。

1 正常呼吸道黏液特征

呼吸道的黏液層（mucus layer）是阻礙肺部吸入藥物吸收的物理屏障，是影響藥物生物利用度和靶向性的重要因素[3]。黏液與纖毛細(xì)胞構(gòu)成黏液纖毛系統(tǒng)，通過(guò)黏蛋白周轉(zhuǎn)和纖毛清除，有效地捕捉并清除病原體、過(guò)敏原等外來(lái)粒子[4]，保護(hù)上皮組織和肺組織，使之免受外來(lái)粒子的侵襲，但同時(shí)也阻礙了藥物在肺部區(qū)域的擴(kuò)散與吸收[5]。

黏液的主要成分為黏蛋白。黏蛋白是一種高分子量的糖蛋白，具有一定數(shù)量的氨基酸的可變串聯(lián)重復(fù)序列[6]。從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，黏液主要是由線型黏蛋白柔韌纖維相互纏繞和交聯(lián)形成的高密度三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)于異物微粒有著很強(qiáng)的捕捉作用。一方面，帶有負(fù)電荷的黏蛋白寡糖的羧基和硫酸基，以及帶正電荷或負(fù)電荷的黏蛋白多肽骨架氨基酸序列，使帶電荷的肺部給藥系統(tǒng)極易通過(guò)靜電相互作用被固定[6?7]。另一方面，Kim等[5]證明了氣道黏蛋白是極其疏水的，黏蛋白的疏水區(qū)域可與疏水性表面微粒產(chǎn)生疏水作用力，進(jìn)而對(duì)異物微粒進(jìn)行有效固定。

宏觀上，氣道黏液是一種黏彈性膠體，由杯狀細(xì)胞合成并不斷分泌到呼吸道表面形成凝膠層，黏液凝膠在纖毛的驅(qū)動(dòng)下移動(dòng)到喉部，一部分被咳出體外，另一部分被吞入消化道。因此肺部吸入的藥物若不能快速通過(guò)黏液層，就會(huì)被清除或吞食[7]。

2 CF患者肺部黏液變化

CF患者CFTR離子通道蛋白的改變會(huì)導(dǎo)致肺氣道上皮細(xì)胞和氣道表面液體之間的異常離子轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。CF患者的肺黏液變化主要包括2個(gè)方面：一是黏液組成的變化，二是黏液性質(zhì)的變化。

2.1 黏液組成的變化

CF患者肺部黏液組成的變化體現(xiàn)在多個(gè)方面。第一是黏液的固體含量增加。由于患者黏液的高分泌和氣道的脫水，肺黏液的固體含量百分比達(dá)到正常的5倍[8]。第二是黏液含有異常水平的復(fù)雜生物大分子。這主要是由于患者感染引起的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞碎片的堆積，比如染色體、DNA和肌動(dòng)蛋白微絲等。而DNA水平的增加可能通過(guò)加強(qiáng)黏液黏附性（由于負(fù)電荷密度的增加）和減少黏液網(wǎng)的大小（由于黏液網(wǎng)中的纏結(jié)）來(lái)增強(qiáng)黏液屏障[9]。第三是黏液黏蛋白自身性質(zhì)的改變。在肺黏液中，單個(gè)Ca2+可以中和兩個(gè)負(fù)電荷，維持與相鄰末端聚糖形成緊密的顆粒內(nèi)黏蛋白基質(zhì)。在健康的氣道表面液體中富含HCO3?，它螯合了交換成Na+的Ca2+，有效地將Ca2+從帶電荷的黏蛋白聚糖之間的離子交聯(lián)中分離出來(lái)。而CF患者由于CFTR在氣道中的HCO3?運(yùn)輸失調(diào)導(dǎo)致Ca2+螯合不當(dāng)，使分泌的黏蛋白保持在半擴(kuò)張狀態(tài)，導(dǎo)致黏液停滯和堵塞[8]。

2.2 黏液性質(zhì)的變化

CF患者黏液性質(zhì)的變化主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：黏彈性增加與pH值降低。第一是黏液具有更高的黏彈性。這是由于CFTR介導(dǎo)的Cl?轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常和上皮鈉通道介導(dǎo)的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)的失調(diào)，導(dǎo)致呼吸道表面液體層（airway surface liquid，ASL）中水的過(guò)度吸收并造成黏液層的脫水。這使得氣道表面液體中非鹽分子的濃度增加，從而使ASL中高濃度黏蛋白與溶質(zhì)?黏蛋白相互作用的聚合物纏結(jié)增加。第二是CF患者的肺部黏液具有比正常肺黏液（pH在6.2~7.4）更低的pH值。這是由于CFTR在CF氣道中的HCO3?運(yùn)輸和隨后的酸化中的作用失調(diào)導(dǎo)致的。最近的研究表明肺黏液的pH值與其黏度呈反比關(guān)系，并推測(cè)這很可能是由于黏蛋白分子之間的靜電相互作用發(fā)生了改變?cè)斐傻模虼溯^低的pH值也可能使黏液黏度增加[8]。

3 基因載體設(shè)計(jì)策略

基因載體系統(tǒng)包括載體本身、輔助因子以及起治療作用的核酸分子。載體起到的是快速轉(zhuǎn)運(yùn)并保護(hù)藥物的作用；輔助因子可以改變黏液和載體的性質(zhì)，提升納米粒的穿透力；核酸分子可以在肺部上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中發(fā)揮作用，調(diào)控氣道黏液的過(guò)度分泌。設(shè)計(jì)納米載體時(shí)需考慮到多重因素，下文將闡述針對(duì)這些因素來(lái)明確納米粒的設(shè)計(jì)策略。

設(shè)計(jì)黏液穿透基因載體，主要考慮的因素有：一是黏液層的厚度及孔徑大小，這會(huì)影響?zhàn)ひ捍┩傅姆绞剑欢禽d體本身能否有效與藥物其他成分結(jié)合；三是對(duì)載體的修飾以及共載黏液降解劑等，可以減少基因載體在黏液中的聚集、絮凝，削弱黏液對(duì)載體的阻滯作用[10]。欲使載體成功穿越黏液，納米粒需要以小于黏液在病理狀態(tài)時(shí)的孔徑大小（約在100~500 nm）在黏液中穿透[11]，保持自身穩(wěn)定性。載體及其表面化學(xué)修飾可以削弱與黏液的黏附作用，避免與免疫分子、炎癥分子等發(fā)生反應(yīng)[12]。同時(shí)，納米粒所攜帶的輔助性因子，具有降低黏液的黏性、孔徑等性質(zhì)，削弱載體與黏液間的靜電作用力、疏水作用力等，減小納米粒對(duì)黏液的黏附。

3.1 載體粒徑的影響

粒徑是載體穿透黏液的重要先決條件。病理?xiàng)l件下，呼吸道黏液中黏蛋白之間的交聯(lián)相比于正常狀態(tài)下更為緊密、牢固，此時(shí)黏液孔徑的范圍處于100~1 000 nm之間，某些網(wǎng)孔的尺寸可能低于100 nm，但也包含直徑在500 nm范圍內(nèi)的更大的互連孔，這取決于黏液的蛋白交聯(lián)密度，總體而言200 nm以下的載體有較好的穿透效率。粒徑在300 nm左右的載體經(jīng)過(guò)修飾之后亦具有良好的穿透效果。粒徑也影響著載體在黏液中的分布以及保留時(shí)間。相比于300 nm以下的載體，粒徑達(dá)到1 000 nm的納米載體在黏液中聚積程度高，2 h后近一半都被機(jī)體清除[14]。

3.2 載體的選擇與修飾

基因載體的選擇十分關(guān)鍵。雖然病毒類載體相較于其他載體有良好的基因遞送效率，但應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，其毒性及免疫原性，對(duì)伴有炎癥反應(yīng)的CF患者的用藥安全構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)[15]。目前應(yīng)用于CF研究的非病毒類載體，主要包括聚合物載體和脂質(zhì)載體，都是陽(yáng)離子載體。這些載體一般依靠靜電相互作用實(shí)現(xiàn)藥物的包載，但他們都存在著靶向性不高以及毒性強(qiáng)的缺陷。為了彌補(bǔ)這些缺陷，研究者往往會(huì)對(duì)載體進(jìn)行修飾。下面我們介紹一些適用于氣道的陽(yáng)離子聚合物載體和陽(yáng)離子脂質(zhì)載體及其修飾方法。

陽(yáng)離子聚合物載體首選聚乙烯亞胺（polyethyle?neimine，PEI）。它優(yōu)點(diǎn)廣泛，其遞送效率優(yōu)于其他陽(yáng)離子聚合物載體。PEI的高電荷密度可以有效地與核酸分子結(jié)合,也可與抗生素發(fā)揮協(xié)同抗菌作用[16]。但它具有一定毒性，且毒性與PEI分子質(zhì)量正相關(guān)。此外，盡管它可以將基因遞送效率提升至5%，但這樣的效率遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到治療CF的要求。究其原因，PEI未經(jīng)修飾時(shí)不具有細(xì)胞選擇性，易與黏液中的巨噬細(xì)胞及血管中的內(nèi)皮細(xì)胞等發(fā)生黏附及轉(zhuǎn)染[17]。為了提高PEI載體對(duì)細(xì)胞的靶向性，配體?受體靶向策略正在被廣泛研究之中。該策略可以增強(qiáng)納米粒對(duì)細(xì)胞選擇性，提高轉(zhuǎn)染效率。如乳鐵蛋白與支鏈PEI的分子結(jié)合，利用人支氣管BEAS?2B上皮細(xì)胞的乳鐵蛋白受體高表達(dá)這一性質(zhì)，使得轉(zhuǎn)染效率顯著提高，同時(shí)也能降低藥物毒性[18]。

多聚賴氨酸（poly?L?lysine，PLL）是最早應(yīng)用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)離子聚合物載體，其毒性強(qiáng)的缺陷可以通過(guò)PLL主鏈與多種分子如聚乳酸?羥基乙酸（poly(latic?co?glycolic acid），PLGA）和 聚乙二 醇（polyethylene glycol，PEG）等接枝，降低其細(xì)胞毒性[19]；又如表達(dá)囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)劑（cystic fibrosis transmem?brane conductance regulator，CFTR）的質(zhì)粒DNA和PLL與絲氨酸酶復(fù)合物（serine enzyme complex，SEC）綴合形成納米復(fù)合物，可以校正氯離子通道的活性，減少溶質(zhì)與黏蛋白的纏結(jié)，擴(kuò)大載體滲透的空間[19]；實(shí)驗(yàn)表明PLL與魚精蛋白結(jié)合使用的霧化劑，可以將轉(zhuǎn)染效率提高3~17倍。

低毒性的、轉(zhuǎn)染效率與PEI相似的聚合物殼聚糖載體，其與黏蛋白聚合物較易發(fā)生相互作用。三糖支鏈修飾可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染基因在上皮細(xì)胞的表達(dá)；殼聚糖與PEI的共軛作用能增強(qiáng)載體的電荷密度，進(jìn)一步降低毒性[21?22]。目前，殼聚糖DNA復(fù)合體干粉制劑有著光明的應(yīng)用前景。

陽(yáng)離子脂質(zhì)載體由與DNA結(jié)合的正電荷側(cè)鏈以及促進(jìn)細(xì)胞膜滲透的脂質(zhì)區(qū)構(gòu)成。盡管在早期體外實(shí)驗(yàn)研究中陽(yáng)離子脂質(zhì)載體表現(xiàn)出較為成功的轉(zhuǎn)染[23]。但在臨床應(yīng)用中，陽(yáng)離子脂質(zhì)載體體內(nèi)低轉(zhuǎn)染效率導(dǎo)致劑量需求的增大，以及其刺激巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)兩大因素疊加的毒性等缺點(diǎn)十分明顯[24?25]。為提升脂質(zhì)載體被細(xì)胞特異性攝取的能力，轉(zhuǎn)鐵蛋白等靶向蛋白可以加入到載體中[26]。霧化的脂質(zhì)載體不僅保留了藥物轉(zhuǎn)染氣道上皮細(xì)胞的能力，保持藥物原有的脂質(zhì)與質(zhì)粒DNA的比例[27]，并且有可能較少地誘導(dǎo)聚集或絮凝，減少藥物被黏液清除的概率[28?29]。陽(yáng)離子脂質(zhì)載體同樣可以依靠親水性聚合物（如PEG）的表面修飾提高黏液穿透特性[30?31]。脂質(zhì)載體對(duì)不同類型細(xì)胞的特異性有高有低，故應(yīng)針對(duì)病灶合理選擇藥物載體。

3.3 各種輔助因子的作用

輔助因子主要可分為親水聚合物的表面修飾，共載黏液降解劑和滲透劑3大類。各種輔助因子可以改變納米粒或黏液的性質(zhì)，使得納米粒與黏液的黏滯作用減小，提高藥物遞送效率。

PEG是常用的親水聚合物之一，其作用在上文已略有提及。PEG是不帶電荷的親水性聚合物。PEG表面修飾可以使載體在黏液的溶解度增加，并增強(qiáng)其生物相容性，實(shí)現(xiàn)納米粒與黏液其他成分的共存，增強(qiáng)納米粒穩(wěn)定性。PEG本身的作用是使得納米粒更易與黏液黏附從而順利進(jìn)入黏液，但高密度的PEG可以適當(dāng)削弱這種作用，增強(qiáng)載體藥物傳遞效率；同時(shí)高密度PEG屏蔽納米粒的疏水核心，避免核心與外界的化學(xué)反應(yīng)[32]。值得一提的是PEG會(huì)削弱納米粒的內(nèi)體逃逸作用，所以PEG修飾的納米粒要盡可能在被內(nèi)體捕捉之前脫下其PEG鏈[33?34]。然而PEG載體電中性及親水表面會(huì)削弱載體與細(xì)胞膜的親和力，相比之下，親水性高分子的N?（2?羥丙基）甲基丙烯酰胺聚合物（poly?N?(2?hydroxypropyl)methacrylamide，pHPMA）有著與細(xì)胞膜更高的親和力，其包被載體后可使載體表面具有負(fù)電性和親水性，可以減少載體與黏蛋白之間的親和力，提高穿透能力，從而使載體很好地適應(yīng)黏液和上皮細(xì)胞表面不同的生化特性[35?36]。此外，具有親水性的 聚（2?乙 基?2?惡 唑 啉）（poly(2?ethyl?2?oxazoline)，POZ）修飾載體可以達(dá)到同PEG修飾的載體相似的效果，即大幅提高載體在黏液中的分散能力以及使電性趨于中性；同時(shí)，在質(zhì)量相同的條件下，POZ修飾的載體相比于PEG修飾的載體粒徑更小，擴(kuò)散系數(shù)更高。POZ修飾載體也比PEG修飾的更易合成、修飾，更易被腎臟代謝減少聚積[37?38]。

黏液溶解劑往往含有巰基，能夠分解黏蛋白中的二硫鍵并有可能降低黏液黏度與彈性。代表性的黏液降解劑NAC的作用是切割黏蛋白纖維之間的二硫鍵分子交聯(lián)，從而顯著降低氣道黏液的黏彈性，同時(shí)可以擴(kuò)大黏液的孔徑，增強(qiáng)藥物遞送效率[39]。另外，NAC也有免疫抑制劑的作用[40]。但單獨(dú)應(yīng)用NAC不足以應(yīng)用于黏膜黏附陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物的臨床相關(guān)治療。利用綿羊氣管細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)表明，在使用NAC修飾納米粒轉(zhuǎn)染之前30 min肌內(nèi)注射格隆溴銨（黏液分泌抑制劑）可以提升基因遞送效率[41]。

重組人源DNA酶（rhDNase）也具有改變黏液性質(zhì)的作用。它能減少黏液的黏彈性，與脂質(zhì)體載體合用可以提高轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)率[42]。但rhDNase將黏液中的DNA分子降解為小片段，小片段擴(kuò)散到黏液微孔中，增加了黏液的微觀黏度，對(duì)200 nm直徑的尺寸略大的載體穿透有一定阻礙[43]。同時(shí)，黏液中的肌動(dòng)蛋白單體可以使rhDNase失活。所以，單獨(dú)使用rhDNase雖然能從總體上降低黏液黏度，但無(wú)法提高載體在黏液中的滲透能力。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)rhDNase與NAC合用時(shí)，其滲透效率是單獨(dú)使用NAC的兩倍以上[44]。因此采用NAC?rhDNase合用的方法可以實(shí)現(xiàn)更高效率的藥物遞送。

以高滲鹽水和甘露醇為代表的滲透劑通過(guò)提高黏液滲透壓，稀釋黏液凝膠層削弱氣道黏液的屏障性質(zhì)。吸入高滲鹽水治療也可使黏液的睫狀體周層（pericili?ary layer，PCL）更易被吸入的基因載體滲透。但在臨床應(yīng)用前或臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)評(píng)估高滲劑水合作用的動(dòng)力學(xué)，以確定預(yù)處理方法和給藥時(shí)間間隔[45]。目前這種方法的藥效與安全性有待評(píng)估。

4 黏液穿透納米粒穿透效果的表征方法

黏液穿透納米粒穿透效果相關(guān)表征可大致分為2個(gè)方面：納米粒與黏液間相互作用的表征和黏液擴(kuò)散情況的表征。以下作簡(jiǎn)要介紹。

納米粒與黏液間的相互作用可通過(guò)測(cè)量粒徑和電動(dòng)電勢(shì)（Zeta potential）的變化[18,46]，或利用流變學(xué)法表征[25,47]。粒徑和電動(dòng)電勢(shì)的變化可以表征納米粒在黏液中孵育后表面性質(zhì)的變化，從而提供關(guān)于黏液對(duì)納米粒吸附性的信息[48]。

黏液擴(kuò)散情況的表征可通過(guò)擴(kuò)散室（diffusion chamber）、二室擴(kuò)散系統(tǒng)（transwell diffusion system）、三室擴(kuò)散系統(tǒng)（transwell?Snapwell system）等體系實(shí)現(xiàn)[47,49]。其中涉及到的表征方法包括但不限于熒光漂白恢復(fù)（fluorescence recovery after photobleaching）、硅膠管離心法（silicone tube centrifugation）、多粒子追蹤法（multiple particle tracking）[18,25,47,49]。其中，熒光漂白恢復(fù)技術(shù)可表征納米基因載體有效擴(kuò)散系數(shù)，并評(píng)估納米基因載體在黏液中的擴(kuò)散率[7]；硅膠管離心法可表征擴(kuò)散深度；多粒子追蹤法可表征多個(gè)納米粒的擴(kuò)散情況及其所處環(huán)境的信息。

5 結(jié)論和展望

由于肺本身的屏障以及CF患者氣道黏液發(fā)生的病理變化，基因藥物難以到達(dá)CF患者病灶。在給藥途徑上，相比于口服或注射，肺部吸入給藥可以有效提高病灶局部藥物濃度，降低系統(tǒng)毒副作用，是以基因療法治療CF的理想給藥途徑。納米粒作為一種新型的遞藥系統(tǒng)，具有生物相容性好、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，可以作為遞藥載體。如果能針對(duì)肺部吸入納米遞藥系統(tǒng)存在黏液穿透能力不足的瓶頸問(wèn)題，通過(guò)表面修飾及共載黏液降解劑等多種策略設(shè)計(jì)黏液穿透型納米粒，并通過(guò)多種表征方式評(píng)價(jià)其遞藥效果，則有望實(shí)現(xiàn)通過(guò)肺部吸入給藥的途徑，使基因藥物到達(dá)CF患者病灶，從而有效提高病灶局部藥物濃度，達(dá)到以基因療法治療CF的效果。