鐵自噬與鐵死亡在中樞神經系統疾病中的研究進展*

趙玉萍 沈俊 余靜梅 李密 謝杉沙 綜述 季一飛 審校

(1.南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院神經內科，四川 南充 637000；2.昆明醫科大學第一附屬醫院急診醫學科，云南 昆明 650000)

在中樞神經系統中，鐵元素參與了許多重要的過程，如氧輸送、氧化磷酸化、髓鞘生成以及神經遞質的合成和代謝[1]。鐵在細胞內的主要儲存形式是鐵蛋白[2]，鐵蛋白是由24個鐵蛋白重鏈(FTH1)和輕鏈(FTL)亞基組成的胞漿雜多體[3]。當鐵缺乏時，鐵自噬(Ferritinophagy)會被激活，由核受體共激活因子4(nuclear receptor coactivator，NCOA4)介導細胞內鐵蛋白轉運到自噬溶酶體中降解釋放出游離鐵以供機體使用[4]。當鐵自噬過度激活時，細胞內過量的鐵沉積會誘導谷胱甘肽(glutathione, GSH)耗竭以及谷胱甘肽過氧化物酶4 (glutathione peroxidase 4，GPX4)的表達減少，最終引起細胞的鐵死亡[5]。鐵死亡是細胞死亡的一種非凋亡形式，其經典特征是基于鐵依賴的脂質活性氧的積累。在中樞神經系統中異常的鐵穩態也會產生脂質活性氧的積累而引起神經元的損傷。這種損傷機制在許多中樞神經系統疾病中被觀察到，包括阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)、蛛網膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage，SAH)、創傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury，TBI)、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)和腦卒中(stroke)等[6]。近年來，對鐵死亡與中樞神經系統疾病關系的研究越來越多。因此，鐵自噬與鐵死亡有望成為神經系統疾病的治療靶點之一。本文就鐵自噬與鐵死亡在中樞神經系統疾病中的作用做一綜述。

1 鐵自噬

自噬(autophagy)是細胞內存在的一種防御和應激調控機制，通過溶酶體途徑降解受損蛋白質和細胞器等進行“自我消化”。自噬存在于任何真核細胞，其有利于細胞代謝與更新，能夠維持細胞內環境的穩態。典型的自噬大約需要30種自噬相關蛋白(Atg)的協同參與，形成雙膜囊泡狀的自噬體，以非選擇性和選擇性兩種方式結合細胞中需要降解的組織，最終轉運到溶酶體中降解[7]。鐵自噬是一種選擇性自噬，由NCOA4介導細胞內鐵蛋白轉運到自噬溶酶體中降解釋放出游離鐵。GAO MH等[8]在胰腺癌細胞系中敲低自噬相關基因5 (Autophagy-related gene 5，ATG5)和自噬相關基因 7(Autophagy-related gene 7，ATG7)揭示了自噬和鐵自噬的關系：自噬介導NCOA4-鐵蛋白復合體運轉至溶酶體，并降解鐵蛋白釋放出游離鐵。NCOA4在嚙齒類動物中有多個剪接異構體，在人類只有兩個：分子質量為70 kDa的NCOA4α蛋白和分子質量為35 kDa的NCOA4β蛋白[9]。NCOA4α是一種具有N端盤繞結構域和C端結構域的蛋白，C端結構域含有FTH 1的結合位點，NCOA4β與NCOA4α共享N端結構域和部分C端結構域。NCOA4通過其C端的FTH 1結合位點與鐵蛋白結合形成NCOA4-鐵蛋白復合體，然后傳遞給自噬體并最終與溶酶體融合導致鐵蛋白的降解和鐵的釋放，這一過程被稱之為鐵自噬[10]。研究表明，NCOA4基因敲除后細胞中NCOA4-鐵蛋白復合體形成受阻，即鐵蛋白向溶酶體的轉運也受阻，從而阻斷了細胞的鐵自噬[11]。近年來關于鐵自噬與中樞神經系統疾病的研究也越來越多，文中將探討調節鐵自噬在中樞神經系統疾病中的治療潛力。為鐵自噬在中樞神經系統疾病發生、發展過程中的作用奠定理論依據。

2 鐵自噬與鐵死亡

細胞死亡在生理和病理條件下都是無法避免的重要環節。傳統意義上細胞死亡主要分為凋亡 (apoptosis) 和壞死 (necrosis) 兩大主要類型, 但近年來越來越多的研究證明，在諸多病理生理情況下也有自噬(autophagy)、脹亡(oncosis)、副凋亡(paraptosis)、焦亡 (pyroptosis) 等多種方式參與其中[5]。研究表明，鐵自噬可調節鐵死亡，這是一種以鐵依賴的脂質過氧化物積累為基礎介導的新型程序性的細胞死亡形式[11]。2012年，Dixon等[5]在cell報道了一種新型程序性、非凋亡性質的細胞死亡方式—鐵死亡，是一種新近公認的細胞死亡類型。鐵死亡依賴于細胞內游離鐵含量，在形態、生物化學和基因上都不同于凋亡、壞死和自噬。是由致癌性小GTP酶蛋白質超家族(RAS家族)中選擇性致死性小分子(Erastin)誘發的一種獨特的鐵依賴的非凋亡細胞死亡形式，Erastin通過抑制胱氨酸/谷氨酸逆轉運體(system xc-)誘導細胞發生鐵死亡。system xc-是一種反向轉運蛋白，由催化亞基(SLC7A11)和伴侶亞基(SLC3A2)組成，可將谷氨酸轉出細胞的同時將胱氨酸轉入細胞內[12]。轉入細胞內的胱氨酸是GSH合成的重要原料。GSH又是谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活化的輔助因子，GPX是維持細胞內的氧化還原平衡的重要物質[13]。當GPX活化受到抑制時，細胞抗氧化能力降低，細胞內的脂質活性氧升高，最終誘發細胞鐵死亡[5]。研究發現，通過上調轉鐵蛋白受體1(Tfr1)和下調FTH 1和FTL以及誘導GSH和GPX4的減少可以引起線粒體萎縮、染色質濃縮、細胞質和細胞器腫脹和質膜破裂，最終導致細胞死亡[14]。越來越多的研究表明，鐵死亡與許多中樞神經系統疾病的病理生理過程密切相關。如何通過調控鐵自噬減少鐵死亡，來干預相關疾病的發生和發展已成為近年來科學家研究的熱點和重點。

3 鐵自噬和鐵死亡與中樞神經系統疾病的相關性

3.1 鐵自噬和鐵死亡與阿爾茨海默病(AD)的相關性 癡呆癥是全球普遍存在的公共衛生問題。目前全世界大約有4700萬人患有癡呆癥，預計到2050年這一數字將增加到1.31億[15]。AD是癡呆癥的主要病因，占50%～75%，是一種不可逆轉的、漸進的大腦障礙，特征癥狀包括：累進性記憶喪失、行為改變、妄想和幻覺，以及精細的運動技能退化[16]。其雖然是在一個多世紀前(1906年)發現的，盡管做了大量的研究工作，但至今還沒有找到治愈的方法。AD的發病機制涉及多種毒性途徑，如蛋白質異常聚集、炎癥和神經遞質水平降低等[17]。其中，淀粉樣蛋白β(Aβ)在神經元外區的聚集和細胞內Tau蛋白的異常過度磷酸化被認為是AD的主要標志[18]。大腦神經元中大量的淀粉樣蛋白β(Aβ)集聚并與N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)結合，NMDA受體是大腦中主要的興奮性突觸中存在的受體，從而影響著突觸后神經元的電活動和鈣動力學的變化，最終導致神經元的死亡[19]。過度激活鐵自噬(Ferritinophagy)導致鐵平衡失調以及由此產生的活性氧(ROS)的氧化應激是否和AD胞內大量的鈣離子涌入誘導損傷性ROS產生導致神經元死亡有相關性？脂質過氧化和鐵調節異常是鐵死亡的特征，在AD腦中早已經被發現[20]。環境中鐵過載會催化ROS的形成，加速AD患者病程進展，主要表現在AD患者腦組織中的老年斑和神經原纖維纏結(Nfts)[21]。在最近的一項研究中，具有特定大腦皮層和海馬神經元GPX4敲除的小鼠在水迷宮測試中表現出明顯的認知障礙，以及海馬神經元的退化。退化的神經元可能正在發生鐵死亡，因為當給小鼠喂食高維生素E飲食或服用鐵死亡抑制劑時，神經退行性變的水平降低[22]。Banerjee P等[23]通過使用鐵螯合劑：黃酮神經肽(5,6-二羥基-7-甲氧基黃酮)證明了大量鐵在AD腦中積累的不利影響可能包括氧化應激、改變淀粉樣蛋白(Aβ)的代謝和金屬結合的淀粉樣蛋白β42的毒性增加。長期鐵過載會誘導GSH、H2O2和GPX酶活性顯著增加，鐵超載可改變神經保護和AD相關基因的表達水平，并呈劑量依賴性。也會誘導乙酰膽堿酯酶(AChE)和參與調節腦組織應激代謝的 mRNA的高表達，最終加速AD神經元的死亡[24]。富含膽固醇的飲食會引起AD樣病理改變，并在高膽固醇飲食的兔腦中發現大量鐵沉積。用鐵螯合劑喂養高膽固醇血癥引起的AD病理改變的兔子，發現鐵螯合劑能顯著降低Aβ40和Aβ42以及β-分泌酶1(BACE1)的水平，BACE1是引發淀粉樣蛋白(Aβ)前體裂解產生Aβ的酶。鐵螯合劑還降低了膽固醇飲食引起的Tau蛋白磷酸化的增加，盡管鐵螯合劑治療腦鐵水平沒有任何變化，但與血漿鐵和膽固醇水平的顯著下降有關。研究證明了，鐵螯合劑可提供針對高膽固醇血癥引起的AD病理改變的重要保護作用[25]。鐵自噬與鐵死亡引起的鐵過載和氧化應激以及過度磷酸化的Tau蛋白會加速AD神經元的死亡，但是鐵、氧化應激和過度磷酸化的Tau蛋白三者之間相互作用機制目前尚不清楚[16]。這些研究表明，鐵死亡可能影響管理學習和記憶的神經元，也可能在神經元死亡中發揮著重要作用。如果能減少AD相關性癡呆的發生，將給個人、家庭和社會帶來重大的好處。

3.2 鐵自噬和鐵死亡與缺血性腦卒中(ischemic stroke) 每年大約有79.5萬人經歷新的或復發性的腦卒中，其中87%是缺血性腦卒中[26]。當頸內動脈、中腦動脈或椎/基底動脈閉塞而導致大腦某些部位的血液供應受限時，就會發生缺血性腦卒中[27]。由此導致的氧和營養物質的消耗可能導致細胞激活缺血級聯反應，從而導致氧化應激、線粒體損傷，并最終導致死亡[28]。鐵是導致高活性羥基自由基形成的關鍵元素，由于它的豐度、生物利用度以及與高度擴散的過氧化氫(H2O2)的相互作用，因此在任何細胞中都有可能通過與鐵有關的機制發生損傷[29]。在發現鐵死亡之前，我們已經知道，無論是在臨床還是缺血卒中動物模型中，鐵的積累會加劇再灌注過程中的神經元損傷[30]。已有研究表明，鐵螯合劑可以減少缺血事件后再灌注損傷[31]。2013年，Speer等[32]推測，鐵死亡可能導致腦缺血引起的神經元死亡，缺氧誘導因子(HIF)脯氨酰羥化酶可能是金屬螯合劑作用的靶點。研究者進一步假設，鐵螯合劑能夠防止鐵死亡是由于抑制了2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶和HIF脯氨酰羥化酶，而不是直接抑制活性氧的形成。2017年的一項研究表明，在大腦中動脈閉塞模型中，抑制鐵死亡可保護小鼠免受缺血-再灌注損傷，表明鐵死亡參與了缺血性腦卒中后神經元的死亡[33]。

3.3 鐵自噬和鐵死亡與蛛網膜下腔出血(SAH) SAH是指腦底部或腦表面的病變血管破裂致血液流入蛛網膜下腔引起的急危重癥，死亡率高達50%，而且超過50%的幸存者會遺留神經功能障礙[34]。早期腦損傷(early brain injury, EBI)是指蛛網膜下腔出血后72 h內發生的一系列病理生理變化，主要涉及顱內壓及腦灌注壓異常，腦血流自動調節紊亂，血腦屏障(BBB)破壞和腦水腫，氧化應激、凋亡信號通路激活和炎癥性損傷等[35]。SAH后過度激活的鐵自噬造成鐵穩態破壞，腦組織中鐵過載會加重SAH后EBI[36]。2019年梁譯丹等[37]通過動物實驗發現，在大鼠SAH模型中鐵自噬可能通過降解神經元內鐵蛋白,導致神經元內游離鐵含量增加,促進神經元鐵死亡,加重SAH后EBI。Wang等[38]通過在實驗中發現，在大鼠SAH后EBI模型中使用α-硫辛酸(LA)的胺衍生物(LAP)來干預SAH后神經元的繼發損傷，證明了α-硫辛酸的胺衍生物(LAP)可以通過螯合溶酶體鐵來保護神經元免受氧化劑的攻擊。Mori等[39]通過實驗發現，SAH后蛛網膜下腔中Fe(2+)、Fe(3+)鐵離子產生增加，證明了ROS是SAH后腦血管痙攣的主要病因。SAH后，內質網應激相關因子CCAAT /增強子結合蛋白(C/EBP)的同源蛋白(CHOP)通過調節CCAAT /增強子結合蛋白-α(C/EBPα)活性來促進鐵調素的表達，從而增加腦鐵含量，誘導鐵依賴性細胞死亡，影響著SAH后EBI的發展[40]。通過大鼠實驗發現，阻斷線粒體鈣單向轉運蛋白(MCU)可以使SAH后腦組織中ROS水平和裂解的caspase-3水平顯著降低。從而減輕SAH引起的鐵蓄積和相關的傷害，通過阻斷MCU來抑制細胞鐵自噬和鐵穩態的破壞有望成為治療SAH的新方向[41]。

3.4 鐵自噬與鐵死亡和創傷性腦損傷(TBI) TBI又稱顱內損傷，發生于突然的外力損傷大腦，導致神經功能損害[42]。TBI分為原發性損傷和繼發性損傷，原發性損傷不可逆轉，因此如何減輕繼發性損傷，就成為當今TBI最重要的治療策略。繼發性腦損傷是由于腦組織缺血、缺氧或微環境改變而引起的。是TBI后神經元死亡的重要原因[43]。Xiao等[44]通過實驗發現，TBI后miR-212-5p在細胞內表達減少，增加miR-212-5p的表達能夠抑制神經元鐵自噬引起的鐵死亡，證明了抑制鐵自噬能夠緩解TBI后神經元的繼發性損傷。TBI可觸發多種細胞死亡途徑，也包括鐵自噬誘導的鐵死亡，它是由15-脂氧合酶(15-LOX)介導的脂質氧化產物所介導的細胞死亡途徑。Kenny等[45]用15-LOX抑制劑黃芩素來抑制TBI后細胞鐵死亡，證明了抑制鐵自噬誘導的細胞死亡可從藥物誘導的細胞死亡和體外TBI模型中挽救小鼠海馬神經元細胞系(HT22)。TBI后鐵自噬誘導鐵死亡引起的脂質過氧化在創傷性神經組織損傷的病理生理學中的作用越來越被大家所重視，研究鐵死亡后脂質過氧化的分子機制有可能成為抑制TBI后繼發性神經元死亡的重要方向[46]。

3.5 鐵自噬和鐵死亡與脊髓損傷(SCI) SCI是一種高死亡率及高致殘率的嚴重中樞神經創傷性疾病,給個人、家庭及社會帶來沉重的經濟負擔,目前仍沒有比較有效的治療方案。SCI分為原發性損傷和繼發性損傷，在SCI后，鐵自噬誘導鐵蛋白釋放出來的游離鐵會導致廣泛的脂質過氧化，導致二次細胞損傷即繼發性損傷[47]。在SCI的治療中，通過預防或減輕繼發性損傷，盡可能改善脊髓損傷的微環境是治療脊髓損傷的原則之一。Zhou等[48]通過實驗發現，原花青素(PACS)可顯著降低創傷性脊髓組織中鐵和部分脂質過氧化的標志物的水平，而GSH和GPX4水平明顯升高，PACS能改善SCI小鼠的運動功能，這些結果提示PACS可能通過抑制SCI中鐵自噬誘導的鐵死亡而成為治療脊髓損傷修復的潛在藥物。研究表明，鐵死亡抑制劑SRS 16-86通過上調鐵死亡因子GPX4、GSH和胱氨酸/谷氨酸逆轉運體相關蛋白(system Xc-transporter-relatedprotein，xCT)，下調脂質過氧化標志物(4HNE)，促進SCI后功能的恢復。表明SRS 16-86治療可以減輕SCI后星形膠質細胞增生并提高神經元存活率，有望成為治療SCI的新靶點[49]。研究發現，使用透射電子顯微鏡(TEM)觀察到SCI后受傷脊髓組織中的胞漿和溶酶體鐵蛋白密度均增加，說明了SCI后脊髓組織內鐵自噬可能被激活，導致了受損組織中游離鐵的濃度升高[50]。Yao等[51]使用鐵自噬抑制劑去鐵胺來干預脊髓損傷的大鼠模型，發現了：①去鐵胺組SCI 大鼠模型后肢運動功能的評分(Basso, Beattie and Bresnahan，BBB 運動功能評分)較脊髓損傷組高，去鐵胺組后肢恢復明顯優于脊髓損傷組。②損傷后去鐵胺組脊髓組織中鐵濃度低于脊髓損傷組。③與脊髓損傷組相比，去鐵胺組GPX4、xCT和谷胱甘肽表達明顯增加。④去鐵胺組鐵死亡相關基因Acyl-CoA合成酶家族成員2(ACSF2)和鐵反應元件結合蛋白2(IREB 2)mRNA水平升高。鐵自噬誘導的鐵死亡在脊髓損傷中阻礙脊髓組織的恢復，抑制鐵自噬后能夠改善脊髓損傷的恢復。

4 小結

鐵自噬與鐵死亡與多數中樞神經系統疾病的發生、發展密切相關，抑制鐵自噬能夠減輕神經元的損傷和增加神經系統功能的恢復，提示鐵自噬介導了神經元的損傷。但鐵自噬介導神經元損傷的調控機制有待進一步研究，以及鐵自噬的啟動、信號轉導、對細胞損傷的特異性方面的研究也尚不全面。對鐵自噬與鐵死亡在中樞神經系統中的分子機制和信號通路的深入研究，有望為未來靶向治療鐵自噬相關神經系統疾病提供新的理論依據。