雙氫青蒿素對類風濕關節炎患者外周血單個核細胞TLR/MyD88信號通路的影響研究

閆慧明，安燕，張雪，劉詠梅，秦潔莉，劉遠，王武龍，岳建偉，趙洪

類風濕關節炎（RA）是以慢性破壞性多關節炎為主要表現的自身免疫性疾病，病理變化是自身免疫異常引起的致炎細胞因子和炎性遞質等釋放，其發病機制目前尚未完全明確，如不及時有效診治，70%的患者2年后可發生不可逆的關節破壞、畸形和功能喪失。大量研究證實Toll樣受體（TLR）/髓樣分化因子88（MyD88）信號通路在RA的發病中具有重要作用［1］。MyD88是TLR信號通路中的一個關鍵的轉導蛋白，其死亡結構域的缺失可導致下游產生炎性細胞因子白介素（IL）-6、IL-12及腫瘤壞死因子α（TNF-α）作用明顯減弱，現有研究認為雙氫青蒿素（DHA）及其衍生物對免疫系統有雙向調節作用［2］。國內外關于DHA對RA作用機制的研究較少，認為其可干預TLR介導的信號通路［3］。本研究通過DHA干預RA患者TLR/MyD88介導的信號通路，探討DHA治療RA的可能作用機制，為RA治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月—2018年12月于內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院就診的活動期RA患者10例為觀察組，均符合2010年美國風濕病學會/歐洲抗風濕聯盟（ACR/EULAR）中的相關診斷標準［4］。10例患者中男2例，女8例；年齡25～79歲，平均（52.2±19.5）歲。同時隨機選取本院體檢中心健康體檢者10例為對照組，其中男2例，女8例；年齡29～40歲，平均（34.2±4.8）歲。排除患有血液系統、心腦血管系統及其他自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征等患者。研究對象均簽署了知情同意書。本研究通過了內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院倫理委員會審查。

1.2 試劑與儀器 人外周血淋巴細胞分離液、PBS、RPMI-1640培養基、胎牛血清、Trizol試劑、Ficoll細胞分離液、cDNA第一鏈合成試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自大連寶生物公司，TLR2抗體及抑制劑、MyD88抗體、TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒購自美國Pepro Tech公司，DHA購自四川光大制藥有限公司，熒光定量PCR循環儀購自ABI-7500美國 Thermo公司，Western電泳儀購自美國伯樂公司，流式細胞儀購自美國 Beekton Dickson 公司。

1.3 人外周血淋巴細胞分離、培養 兩組研究對象于清晨空腹時抽取肝素抗凝靜脈血5 ml，立即置于離心機，離心半徑12 cm，4 000 r/min離心10 min分離血漿，收集2 ml于凍存管中存于-80 ℃冰箱備用。實驗前室溫凍融凍存管30 min，用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMCs），調整細胞濃度至5×106/ml，接種于24孔細胞培養板，每孔1 ml，置于37℃ 5%CO2培養箱中培養4 h后棄上清，將37 ℃預熱PBS輕洗細胞培養板2遍，獲得貼壁的PBMCs。RPMI-1640完全培養基重懸（內含100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素，10%胎牛血清）PBMCs。將PBMCs分為5組，每組設5個復孔。（1）對照組：健康志愿者外周血PBMCs，不給予干預TLR介導的信號通路；（2）RA組：RA患者外周血PBMCs，不給予干預TLR介導的信號通路；（3）TLR2抑制劑組：RA患者外周血PBMCs，給予100 μg/L的TLR2抑制劑干預TLR介導的信號通路；（4）DHA低劑量組：RA患者外周血PBMCs，給予200 μmol/L的DHA干預TLR介導的信號通路；（5）DHA高劑量組：RA患者外周血PBMCs，給予1 000μmol/L的DHA干預TLR介導的信號通路。置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后收獲細胞。

1.4 TLR2陽性率檢測 采用雙色熒光法檢測PBMC上TLR2陽性率，用Cell Quest軟件獲取和分析數據。

1.5 RT-PCR法 檢 測TLR2 mRNA、MyD88 mRNA Trizol法提取外周血PBMCs的總RNA，紫外分光光度儀測定RNA的質量和濃度。采用Primer5軟件設計引物（南京金斯瑞科技有限公司，見表1）。取RNA樣品5 μl，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參基因，使用試劑盒逆轉錄合成cDNA。Real-time PCR反應條件：94 ℃、5 min×1 次，94 ℃、30 s，52 ℃、15 s，72 ℃、30 s，循環35次，72 ℃、5 min×1次。溶解曲線：以60 ℃為初始溫度，每隔30 s升高0.5 ℃，直到溫度上升至95 ℃，測定TLR2 mRNA、MyD88 mRNA。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.6 Western blotting法檢測TLR2、MyD88 用等量的蛋白樣本（50 μg）進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉過夜（4 ℃），棄封閉液。加入封閉液稀釋好的TLR2、MyD88及GAPDH抗體（1∶1 000），TBST漂洗濾膜4次，10 min/次。將膜與辣根過氧化酶標記的二抗（1∶5 000），室溫下搖蕩孵育2 h，然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，10 min/次。顯影液置膜上，凝膠成像儀成像。GAPDH表達作為內參蛋白，得出TLR2/GAPDH，MyD88/GAPDH的比值。

1.7 ELISA法檢測TNF-α、IL-6水平 使用酶標儀ELISA方法檢測上清液中TNF-α、IL-6水平，具體實驗操作按照試劑盒說明書進行。

1.8 統計學方法 應用SPSS 21.0軟件進行數據的處理分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗，若方差不齊用Dunnett's T3檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLR2陽性率比較 5組TLR2陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中RA組TLR2陽性率高于對照組、TLR2抑制劑組，差異有統計學意義（P＜0.05）；DHA低劑量組TLR2陽性率高于對照組、TLR2抑制劑組、DHA高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 五組TLR2陽性率比較（±s，%，n=3）Table 2 Comparison of the TLR2 positive expression rate in five groups

表2 五組TLR2陽性率比較（±s，%，n=3）Table 2 Comparison of the TLR2 positive expression rate in five groups

注：DHA=雙氫青蒿素，RA=類風濕關節炎；與對照組比較，aP＜0.05；與TLR2抑制劑組比較，bP＜0.05；與DHA低劑量組比較，cP＜0.05

組別 TLR2陽性率對照組 0.03±0.01 TLR2抑制劑組 1.05±0.32 RA組 5.93±2.31ab DHA低劑量組 3.65±1.02ab DHA高劑量組 2.38±0.96c F值 12.536 P值 ＜0.001

2.2 TLR2 mRNA、MyD88 mRNA比 較 5組 TLR2 mRNA、MyD88 mRNA比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中RA組TLR2 mRNA、MyD88 mRNA高于對照組、TLR2抑制劑組，差異有統計學意義（P＜0.05）；DHA低劑量組TLR2 mRNA、MyD88 mRNA高于對照組、TLR2抑制劑組、DHA高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

表3 五組TLR2 mRNA、MyD88 mRNA比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of the expression levels of TLR2 mRNA and MyD88 mRNA in five groups

表3 五組TLR2 mRNA、MyD88 mRNA比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of the expression levels of TLR2 mRNA and MyD88 mRNA in five groups

注：與對照組比較，aP＜0.05；與TLR2抑制劑組比較，bP＜0.05；與DHA低劑量組比較，cP＜0.05

組別 T L R 2 m R N A M y D 8 8 m R N A對照組 0.9 3±0.3 2 0.9 9±0.3 8 T L R 2抑制劑組 1.3 2±0.4 3 1.5 3±0.6 8 R A 組 5.4 3±2.3 8 ab 6.1 8±3.1 9 ab D H A低劑量組 4.4 2±2.1 5 ab 5.1 2±2.3 5 ab D H A高劑量組 3.5 1±1.7 3 c 3.1 7±2.0 1 c F值 9.2 8 3 1 5.7 3 6 P值 0.0 0 1 ＜0.0 0 1

2.3 TLR2、MyD88比 較 5組 TLR2、MyD88比 較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中TLR2抑制劑組、RA組、DHA低劑量組、DHA高劑量組TLR2、MyD88高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。RA組TLR2、MyD88高于TLR2抑制劑組，差異有統計學意義（P＜0.05）；DHA低劑量組TLR2、MyD88高于DHA高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

表4 五組TLR2、MyD88比較（ ±s，n=3）Table 4 Comparison of the expression levels of TLR2 and MyD88 in five groups

表4 五組TLR2、MyD88比較（ ±s，n=3）Table 4 Comparison of the expression levels of TLR2 and MyD88 in five groups

注：與對照組比較，aP＜0.05；與TLR2抑制劑組比較，bP＜0.05；與DHA低劑量組比較，cP＜0.05

組別 T L R 2 M y D 8 8對照組 0.0 2 1±0.0 1 1 0.0 2 4±0.0 1 4 T L R 2抑制劑組 0.3 0 2±0.0 4 3 a 0.2 3 3±0.0 2 1 a R A 組 0.9 3 1±0.0 1 8 ab 1.0 1 3±0.0 1 9 ab D H A低劑量組 0.4 6 2±0.0 1 9 a 0.6 3 2±0.0 3 5 a D H A高劑量組 0.2 8 1±0.0 2 1 ac 0.3 0 1±0.0 1 6 ac F值 5.3 7 5 3.1 8 4 P值 0.0 0 2 0.0 0 5

2.4 TNF-α、IL-6水平比較 5組TNF-α、IL-6水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中TLR2抑制劑組、RA組、DHA低劑量組、DHA高劑量組TNF-α、IL-6水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。RA組TNF-α、IL-6水平高于TLR2抑制劑組，差異有統計學意義（P＜0.05）；DHA低劑量組TNF-α、IL-6水平高于DHA高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表5）。

表5 五組TNF-α、IL-6水平比較（ ±s，mmol/L）Table 5 Comparison of TNF-α and IL-6 levels in five groups

表5 五組TNF-α、IL-6水平比較（ ±s，mmol/L）Table 5 Comparison of TNF-α and IL-6 levels in five groups

注：與對照組比較，aP＜0.05；與TLR2抑制劑組比較，bP＜0.05；與DHA低劑量組比較，cP＜0.05

組別 例數 TNF-α IL-6對照組 10 1.321±0.419 0.918±0.257 TLR2抑制劑組 10 1.535±0.362a 1.028±0.371a RA組 10 9.693±6.531ab 10.181±5.137ab DHA低劑量組 10 7.465±4.802a 8.472±3.183a DHA高劑量組 10 5.358±3.966ac 6.183±3.174ac F值 15.274 18.387 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

RA是以慢性破壞性多關節炎為主要表現的全身性自身免疫性疾病，基本病理變化是自身免疫異常引起的致炎細胞因子和炎性遞質等的釋放，由此所致的關節滑膜的慢性炎癥、血管翳形成、軟骨和軟骨下骨破壞。研究證實TLR在 RA 的發病中具有關鍵作用。TLR作為膜結合蛋白，可識別病原體不同的分子結構后激活細胞內的信號轉導通路，上調炎性細胞因子和趨化因子，加速炎性反應及炎癥持續時間等［5］。在自身免疫性疾病中以TLR2及其介導的信號通路在RA的發病中具有重要作用，MyD88是TLR信號轉導通路中的一個關鍵的接頭蛋白，對 TLR2信號起負性調控作用［6-7］。諸多學者研究認為DHA及其衍生物對免疫系統有調節作用。目前，國內外關于DHA對RA可能作用機制的研究較少。本研究通過DHA干預RA患者TLR2/TLR4介導的信號通路，探討DHA治療RA的可能作用機制，為RA治療提供可能的理論依據。

本研究結果顯示，RA活動期各組TLR2陽性率高于對照組，RA組TLR2陽性率高于TLR2抑制劑組，提示在RA活動期TLR的表達是增強的，與錢雷等［8］研究表明RA患者關節滑膜襯里層和里襯層TLR2、TLR4蛋白表達水平較骨關節炎患者及健康人明顯偏高的結果一致。其原因可能為RA患者病原體分子結構刺激PBMC處于活化狀態，TLR受體激活，產生大量炎性因子，引起關節炎癥的發生。本研究結果顯示，TLR2抑制劑組PBMCs中TLR2、MyD88表達 、上清液中TNF-α及IL-6水平低于RA組，提示應用TLR2抑制劑后RA患者的TLR下降，炎性因子TNF-α及IL-6水平下降，關節炎性反應降低，病情趨于緩解。與國內外相關研究結果一致，抑制TLR2可以使模型小鼠關節炎的嚴重程度降低，骨破壞及炎性反應減少［9-10］。其原因可能為RA患者通過TLR啟動機體的炎性反應，合成和釋放炎性因子，抑制TLR2后炎性反應降低。本研究結果顯示，DHA低劑量組PBMCs中TLR2、MyD88表達，上清液中TNF-α及IL-6水平高于DHA高劑量組，提示RA患者應用DHA后可以抑制TLR，而且隨著DHA劑量的增大對TLR的抑制作用在增強，與相關研究結果類似，DHA及其衍生物可顯著降低促炎細胞因子IL-6、TNF-α的表達［11-12］。其原因可能為DHA及其衍生物可能對免疫系統具有調節作用，通過抑制TLR2受體減輕炎性反應。

本研究通過體外培養RA患者PBMCs，觀察和檢測不同濃度DHA處理過的RA患者PBMCs增殖程度；通過抑制TLR2/MyD88后，檢測PBMCs 中TLR2、MyD88、TNF-α和IL-6的表達水平，應用DHA作用RA患者PBMCs后，使受刺激后PBMCs增殖程度減低，細胞凋亡加快；隨DHA濃度的改變細胞增殖程度和凋亡也在改變；不同藥物濃度刺激后細胞TLR2、MyD88、TNF-α和IL-6的表達水平在下降，證明了DHA對TLR2、MyD88信號通路具有抑制作用。DHA制劑對RA患者PBMCs的抑制作用機制，為臨床治療RA提供更多的理論依據。

總之，RA的發病機制復雜，在RA的發病機制中除了TLR信號通路外，還有JAK-STAT 信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、PI3K/AKT信號通路、PD-1/PD-L1信號通路、MAPK 信號傳導通路和BMPs信號通路。本文研究只是對DHA對RA患者TLR2/MyD88信號通路的抑制作用做了初步探索，希望能對基礎研究和臨床治療RA提供更多的理論依據。本研究也具有很大的局限性：信號通路之間的相互關系復雜，網絡相互交錯，在抑制TLRs通路時可能對其他信號通路產生不利影響。

作者貢獻：閆慧明進行研究設計與實施、撰寫論文并對文章負責；安燕、劉詠梅、秦潔莉、劉遠、王武龍、岳建偉、趙洪進行研究實施、評估和資料收集；張雪進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。