香豆素類熒光探針對硫化氫檢測的研究進展

劉忠誠 杜美利 韓 翔 薛文海 王瀚姣

(西安科技大學 化學與化工學院，西安 710054)

前言

硫化氫(H2S)是人們發(fā)現(xiàn)的第三類生物內(nèi)源性“氣體信使分子”(其他兩種分別為CO和NO)。內(nèi)源性H2S主要是通過非酶催化和酶催化兩種途徑產(chǎn)生：非酶催化途徑包括多硫化合物的代謝及存儲硫的釋放[1]；酶催化途徑則是在胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CES)等吡哆醛-5-磷酸鹽(PLP)類酶、3-巰基丙酮酸硫轉移酶(MST)和半胱氨酸轉氨酶(CAT)等多種酶的參與作用下，通過酶解L-半胱氨酸產(chǎn)生[2]。H2S對于呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的調節(jié)有著非常重要的意義，參與一系列生理調控活動，如調節(jié)血管舒張、炎癥及胰島素分泌等[3]。但是，細胞內(nèi)H2S濃度平衡(生理濃度1～10 mmol)一旦破壞可能會導致亨廷頓式舞蹈癥[4]、糖尿病[5]、阿爾茲海默癥[6]、21-三體綜合癥[7]及帕金森癥[8]等疾病的產(chǎn)生。因此，對H2S的檢測尤其是對生物內(nèi)源性H2S的定量檢測有著重要意義，這也使得近年來對內(nèi)源性H2S的檢測與研究成為熱點。

目前，常見的H2S檢測方法有：分光光度法[9]、電化學法[10]、氣相色譜法[11]以及極譜法[12]。這些方法操作簡單，但是通常需要破壞樣品，局限于細胞外H2S檢測。近年來發(fā)展的有機小分子熒光探針由于其優(yōu)良的細胞滲透性、高靈敏度以及原位檢測等優(yōu)點，為H2S和其他生物活性分子內(nèi)源性檢測提供了有效的方法，且涌現(xiàn)出一系列豐碩的成果[13-17]。其中以香豆素為母體的H2S熒光探針，因其具有熒光強度高、溶解性與細胞滲透性好、易于合成與修飾、以及優(yōu)越的熒光量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性等優(yōu)勢，備受研究者的青睞。

目前文獻中報道的H2S熒光探針的識別機理主要基于三種設計策略：1)疊氮基(—N3)、硝基(—NO2)、羥胺(—NH2OH)的還原反應；2)親核反應；3)H2S與某些金屬結合能力強，如硫化銅沉淀。本文以不同的識別機理綜述近三年以香豆素為母體設計的熒光探針對H2S的檢測研究。

1 熒光探針法檢測H2S

1.1 基于H2S還原性的熒光探針

H2S能夠將—N3、—NO2、—NH2OH等基團快速還原為—NH2，其還原速度遠高于其他硫醇，從而成為一種有效的H2S識別機制。其中，—N3、—NO2、—NH2OH 等吸電子基團不僅可以作為H2S的識別位點還可以使熒光團的熒光發(fā)生淬滅。當被H2S還原之后，熒光團前后“推-拉”電子能力的變化會引起熒光的恢復(探針和客體分子發(fā)生光誘導電子轉移過程)。基于上述機理，科研工作者充分利用不同取代基的供電子能力，制備出各種各樣的用于檢測H2S的香豆素類熒光探針。

2020年，Selvaraj Muthusamy等人設計了一種含—N3的香豆素(圖1)熒光探針，通過酰胺骨架熒光團與8-氨基喹啉連接，引入雜原子增強了電子離域，從而產(chǎn)生快速的熒光響應和高量子產(chǎn)率。通過波譜和LC-MS分析表明，酰胺骨架-8氨基喹啉(ACAQ)的響應時間為6 min，檢測限(LOD)為14.6 nmol/L，對其他可能的干擾物具有很高的抗干擾性。此外，可視化測量結果表明，探針ACAQ能夠用于現(xiàn)場樣品中H2S的檢測[18]。

圖1 含—N3的香豆素探針的識別位點Figure 1 Recognition sites of coumarin fluorescent probe containing —N3.

2018年，ZHAO等人在7-氨基-4-甲基香豆素和熒光素FRET體系的基礎上，設計了一種新型H2S熒光探針Flu-N3(圖2)，該探針對H2S的檢測限為3.1 nmol/L。此外，HepG-2細胞成像和小鼠活體成像實驗都表明，探針能夠應用于檢測生物系統(tǒng)中的H2S[19]。

2019年，解暢等人合成了一種響應速率相當?shù)臒晒夤舱衲芰哭D移—分子內(nèi)電荷轉移(FRET-ICT)雙反應H2S熒光探針(圖3)。該探針是根據(jù)雙淬滅效應(7-硝基-1，2，3-苯并二唑(NBD)-哌嗪參與的FRET淬滅和—N3參與的ICT淬滅，增加熒光淬滅程度。當探針和H2S反應后，雙淬滅效應同時消失，熒光增強明顯，有效提高探針的靈敏性。探針可以與H2S發(fā)生還原和親核取代反應(H2S將—N3還原為—NH2，氫離子取代NBD)；并且探針中兩個反應基團的反應速率相當，探針對H2S的檢測限為40 nmol/L。此外，探針能夠用于真核細胞內(nèi)CBS(胱硫醚β-合酶)活性檢測和抑制劑篩選，并且可以檢測活細胞中的H2S[20]。

圖2 探針 Flu-N3的識別位點Figure 2 Recognition sites of Flu-N3 probe.

圖3 探針的反應位點Figure 3 Reaction site of probe.

2018年，Ewelina Zaorska等人合成了兩種用于生物液中H2S檢測的自釋放熒光探針(圖4)。自釋放為探針通過H2S介導的疊氮基團還原，生成伯胺，伯胺隨后自發(fā)發(fā)生分子內(nèi)內(nèi)酰胺化，釋放7-羥基-4-甲基-香豆素和哌啶-2-酮。在相同的反應條件下，化合物2的熒光響應要低得多，這是由于化合物2的逐漸自水解所致。化合物2可用于在生物系統(tǒng)和人體體液，以及在生理pH值和快速響應時間的水介質中估測H2S濃度。最后測量了健康的18～40歲志愿者唾液中的H2S，在獲取樣本后立即進行濃度測定。健康人的唾液H2S濃度范圍為1.641～7.124 mol/L[21]。

圖4 熒光探針的結構Figure 4 Structure of fluorescent probe.

2020年，ZHANG等人通過將硝基苯并-2-氧雜-1，3二唑(NBD)的一部分和—N3整合到香豆素平臺上設計了一種新型熒光探針(圖5)，用于生物系統(tǒng)中選擇性檢測半胱氨酸/高半胱氨酸(Cys/Hcy)和H2S。該探針具有較低的細胞毒性，能夠選擇性地檢測Cys/Hcy和從藍色和綠色通道得到海拉細胞(HeLa)中的H2S[22]。

1.2 基于H2S親核性的熒光探針

在生理pH值下，H2S主要以HS的形式存在，與其他硫醇相比，H2S在細胞中具有更高的親核性，可以更好地參與親核反應。基于此機制，提出了兩種策略，一種是芳香硝基化合物的硫解，另一種是共軛體系的破壞。而采用這兩種策略對 H2S 進行檢測所遇到的最大困難就是如何使探針分子特異性與 H2S反應。但H2S擁有雙親核性使得這個問題得以解決，研究者們將熒光探針分子用兩個親電中心進行修飾，以達到能夠使得H2S與探針發(fā)生雙硫醇交換機制或者串聯(lián)邁克爾加成反應機制的目的。利用該機理，科研工作者也設計合成了多種用于檢測H2S的熒光探針。

2020年，韓志湘等人用花色素和4-(二乙氨基)水楊醛合成了一種近紅外比率熒光探針分子1(圖6。結果表明：探針分子1溶液中加入H2S時，因H2S與探針分子1中苯并吡喃部分發(fā)生親核加成反應，破壞了其共軛體系，導致720 nm處的近紅外(NIR)發(fā)射熒光強度降低；同時，其加成產(chǎn)物含有完整的半剛性香豆素熒光團，在503 nm處的綠色熒光強度顯著增強。由于探針1的發(fā)射波長與半剛性香豆素的發(fā)射波長不同，因此在加入H2S前后有兩個完全分離的發(fā)射峰，實現(xiàn)了對H2S的有效比率檢測。當加入4.0 μmol/L硫化鈉時，熒光強度增強了19.2倍。探針分子1對水溶液中的H2S的線性響應范圍是0.1～4 mol/L(R2=0.993 9)，檢測限為57.8 nmol/L。探針分子1對H2S響應時間為110 s，且有較好的選擇性。此外，探針分子1還被成功應用于活細胞中內(nèi)源性和外源性H2S的熒光成像[23]。

圖5 探針的識別位點Figure 5 Recognition sites of probe.

圖6 探針的合成Figure 6 Synthesis of probe.

2021年，TANG等人基于羅丹明和香豆素熒光基團，設計了一種新的雙識別位點探針SZ(圖7)。其中，苯肼和2，4-二硝基苯磺酰分別作為ONOO-和H2S的反應位點。SZ探針對ONOO-和H2S具有良好的選擇性和較低的檢測限；更重要的是，SZ通過監(jiān)測ONOO-的波動來評價內(nèi)源性H2S對羰基脅迫的影響。因此，這種新型的羰基應激標記熒光探針將有助于理解羰基應激的發(fā)病機制和解毒藥物的開發(fā)[24]。

2018年，YANG等人以香豆素為熒光團和二硝基苯基作為高效的熒光猝滅劑設計了一種探針(Cda-DNP) 香豆素-二硝基苯(圖8)。該探針結合了高效的開關效率和顯著的膜穿越能力，可實現(xiàn)細胞和動物體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生的H2S檢測和動態(tài)繪圖。H2S在生物體內(nèi)的檢測具有以下前所未有的優(yōu)點：H2S容易進入幾乎所有的細胞，整個細胞空間映射H2S；單細胞中自發(fā)H2S的動態(tài)定位；動物器官中自發(fā)H2S的體內(nèi)成像。該探針對H2S的檢測限為0.18 μmol/L，特別是，探針穿越血液/組織/細胞屏障，實現(xiàn)對活斑馬魚代謝器官內(nèi)源性H2S的定位。本研究的結果將為研究H2S生理和H2S相關疾病提供令人興奮的機會[25]。

圖7 探針的識別位點Figure 7 Recognition sites of probe.

圖8 探針的識別機理Figure 8 Recognition mechanism of probe.

2020年，ZHANG等人合成了兩種比率型H2S熒光探針(圖9)，該探針選擇香豆素衍生的花青素熒光團作為受體，引入兩個綠色熒光團作為供體。該探針在665 nm處表現(xiàn)出強大的近紅外發(fā)射。HS-與亞胺碳的親核加成反應破壞了花青素的大共軛體系，導致其吸收能力下降，從而阻斷了FRET過程，增加了綠色熒光發(fā)射。探針NBD-CMC和Nap-CMC在水溶液中均表現(xiàn)出特定比例的H2S檢測能力。對H2S的響應時間分別為60和90 s。此外，探針NBD-CMC還成功地應用于細胞內(nèi)外源性和內(nèi)源性H2S的檢測，為H2S比值熒光成像探針的研制提供了有力的設計思路，為H2S各種生理和病理功能的研究奠定了基礎[26]。

2021年，F(xiàn)ENG等人首次設計了一種雙功能三位點熒光探針GH(圖10)，不僅可以將紙條與顏色識別器耦合，對廢水中的H2S進行可視化定量分析，還可以對活細胞中的GSH進行靈敏監(jiān)測，這取決于不同的發(fā)射通道和溶液的pH值。通過熒光、紫外-可見光譜、核磁共振氫譜和密度泛函(DFT)計算，證明了GH對H2S/GSH的識別性能。更重要的是，熒光試紙與帶有顏色識別器應用程序的便攜式智能手機傳感平臺可以實現(xiàn)低成本、快速的比色水質檢測，在環(huán)境監(jiān)測領域顯示出巨大的應用潛力[27]。

圖9 探針的識別位點Figure 9 Recognition sites of probe.

圖10 探針的識別位點Figure 10 Recognition sites of probe.

2019年，LEI等人設計了一種基于香豆素的熒光探針I(yè)AC(圖11)，該探針在580 nm具有較強的紅色熒光，通過DFT和ESI-MS研究了感應過程，發(fā)現(xiàn)親核反應有助于IAC與H2S之間的紅色熒光增強。IAC能快速、選擇性地檢測H2S，檢測限為3.3×10-8mol/L。細胞毒性(MTT)檢測和細胞成像結果表明，IAC具有良好的膜通透性和低毒性，這使得IAC可以應用于活細胞和動物檢測[28]。

圖11 探針的識別位點Figure 11 Recognition sites of probe.

2019年，YANG等人基于α，β-不飽和乙醇香豆素熒光團，設計了用于檢測H2S的探針(圖12)。乙醇/水緩沖液中DHC的紫外-可見光譜在470 nm處有明顯的吸收。加入H2S后，吸收強度降低，從470 nm轉移到482 nm，而其他分析物則不能引起上述現(xiàn)象。該探針對H2S的檢測限低至5×10-8mol/L，響應時間小于60 s。此外，4～11的寬pH值范圍使其能夠在生物系統(tǒng)中應用。最重要的是，MTT實驗和細胞成像實驗表明探針具有低毒和膜透性突出的特點，使探針能夠成功成像于H2S小倉鼠腎(BHK)細胞[29]。

圖12 探針對H2S的反應機理Figure 12 Reaction mechanism of probe to H2S.

2020年，ZHAO等人合成了首個線粒體靶向雙檢測單熒光探針Mit-CM(圖13)，該探針以花青素-香豆素作為熒光團(花青素的染料不僅可以作為能量受體，而且也可以作為4-氨基苯乙烯基4位ICT的能量供體。香豆素基染料的丙烯酸酯能有效淬滅Cys的熒光，并提供特定的識別位點。具有供電子基團的4-氨基苯乙烯基到吲哚的ICT和香豆素到花青素的FRET可以同時發(fā)生)。該探針可分別單獨和連續(xù)顯示H2S、Cys和H2S/Cys的多響應信號。此外，Mit-CM對H2S檢測限低至42 nmol/L。因此，我們期望Mit-CM能成為研究復雜多樣內(nèi)部環(huán)境中相關生物分子間相互關系的有力分子工具。此外，在特定的細胞器中，合理的設計策略應被廣泛應用于構建具有多種功能的單一熒光探針來追蹤生物活性物質[30]。

2020年，LI等人研制了一種雙通道香豆素熒光探針(圖14)。該探針α，β不飽和酮與苯甲醛相鄰，建立了空間阻性反應模型。長鏈GSH既能與探針的α、β不飽和酮反應，又能與醛基反應，從而產(chǎn)生綠色熒光。結構緊湊的H2S首先與α、β-不飽和酮反應，然后巰基與醛發(fā)生二次親核環(huán)化反應，形成一個五元環(huán)將整個分子接合，使體系發(fā)出黃色熒光。實現(xiàn)了兩種發(fā)射通道對GSH和H2S的高選擇性識別檢測。該探針對GSH和H2S的檢測限分別為7.55和28.55 μmol/L。同時，該探針在選擇性、毒性、穩(wěn)定性等方面表現(xiàn)出良好的性能。細胞實驗也證明該探針能同時檢測內(nèi)源性和外源性GSH和H2S[31]。

圖13 探針的識別位點Figure 13 Recognition sites of probe.

圖14 探針的識別位點Figure 14 Recognition sites of probe.

2018年，侯鵬等人以 2，4-二硝基苯基為識別基團，香豆素類染料為信號表達基團，合成了反應型H2S熒光探針(圖15)。熒光團與2，4-二硝基苯基之間的光誘導電子轉移(PET)過程，導致探針的熒光淬滅，探針本身無熒光或發(fā)出很弱的熒光。當加入H2S后，H2S具有較強的親核性，和探針發(fā)生親核取代反應使識別基團脫離，體系內(nèi)PET過程失效；生成具有強烈綠色熒光的香豆素類染料。通過反應前后熒光光譜的變化來檢測H2S。該探針對H2S具有良好的選擇性和靈敏度，可以在生理條件(pH=7.4)下檢測H2S。當探針的濃度為10 μmol/L時，其對H2S的檢測限為3.0×10-8mol/L，在490 nm熒光強度最大增強75倍[32]。

2020年，JING等人設計了一種新的雙發(fā)射溶酶體靶向熒光探針CM-NBD(圖16)，該探針能有效區(qū)分Cys和H2S以及Hcy/GSH雙色模式。探針遇到生物硫醇時，醚鍵破裂，釋放出香豆素熒光團，在465 nm處發(fā)出藍色熒光，NBD發(fā)色團(NBD-cys)發(fā)出強烈的綠色熒光，NBD-Hcy表現(xiàn)出非常模糊的綠色熒光，NBD-GSH/NBD-SH在565 nm處沒有綠色信號。遇到Cys時，CM-NBD在藍、綠通道出現(xiàn)明顯的熒光增強，而Hcy的加入在綠通道表現(xiàn)出有限的增強，GSH和H2S僅呈藍色熒光增強。探針CM-NBD對外源生物硫醇進行了成像實驗，實現(xiàn)了對HeLa細胞和斑馬魚中Cys、Hcy/GSH和H2S的鑒別。這項工作為Cys的特異性檢測以及溶酶體Cys在生物醫(yī)學和生物學中的相關作用提供了一個潛在的工具[33]。

圖15 探針的合成Figure 15 Synthesis of probe.

圖16 探針的識別位點Figure 16 Recognition sites of probe.

2020年，Zhang等人設計了一種新型熒光探針FHC-O-NBD(圖17)，提出了一種實用的熒光鑒別Cys/Hcy和GSH/H2S的方法，特別是對H2S的比色檢測。FHC-O-NBD與Cys/Hcy反應在486和550 nm處產(chǎn)生兩個熒光信號，而GSH/H2S在486 nm處只產(chǎn)生一個熒光信號。而且，只加入H2S，體系的顏色會從無色變?yōu)榉凵Ｒ虼耍梢宰鳛椤叭庋邸睓z測H2S的比色探針。此外，F(xiàn)HC-O-NBD能選擇性地區(qū)分活細胞中的Cys/Hcy和GSH/H2S[34]。

2018年，ZHANG等人合成一種溶酶體靶向熒光探針Lyso-RC(圖18)，用于同時區(qū)分溶酶體中的Cys/Hcy、GSH和H2S。Lyso-RC對不同的生物硫醇反應時，表現(xiàn)出不同的信號模式(分別為藍-紅、綠-紅、紅)，當Lyso-RC與H2S作用時，相應的醚鍵被切斷，釋放出游離的間苯二酚，產(chǎn)生非發(fā)射性的巰基香豆素(Lyso-C-SH)，從而產(chǎn)生強烈的紅色熒光信號。當用GSH處理Lyso-RC時，相應的醚鍵也被切斷，釋放出紅色的間苯二酚和綠色的硫代香豆素(Lyso-C-S-GSH)。我們希望這一獨特的探針能夠成為解開溶酶體中生物硫醇的復雜相互作用網(wǎng)絡的強大分子工具[35]。

圖17 探針的比色檢測Figure 17 Colorimetric detection of probe.

圖18 探針的識別位點Figure 18 Recognition sites of probe.

2019年，ZHANG等人受多信號組合策略的啟發(fā)，首次通過醚鍵將7-二乙基香豆素和間苯二酚結合成功，用于生物硫醇檢測和鑒別的單分子熒光探針RC (圖19)。同時檢測Cys、Hcy、GSH和H2S。令人滿意的是，RC在溶液和活細胞中對各自的生物硫醇表現(xiàn)出不同的信號模式(H2S為紅色，Cys為藍色-紅色，Hcy為藍色-綠色-紅色，GSH為綠色-紅色)。這項工作有可能為發(fā)現(xiàn)同時區(qū)分不同RSS的熒光探針開辟新的途徑，并為闡明生物硫醇復雜的相互作用和確切的生物學功能提供強大的化學工具[36]。

圖19 探針的識別位點Figure 19 Recognition sites of probe.

2018年，YANG等人以2，4-二硝基苯和7-硝基-1，2，3-苯并惡二唑兩個熒光團通過醚鍵合成了一種熒光探針NCQ(圖20)，NCQ有兩個反應位點。對于反應位點1，醚鍵可以被5個硫醇全部切斷，底物釋放出藍色的CQ和非熒光的硫取代的NBD中間體。2號位點僅對噻吩有反應，對Cys/Hcy/GSH/H2S無反應。噻吩可以同時裂解DNB和NBD的醚鍵，釋放出藍色的香豆素1，進而形成紅色的TQC。NCQ溶液對Cys/Hcy、GSH/H2S和硫酚呈現(xiàn)明顯的熒光信號：Cys/Hcy為藍色和綠色，GSH/H2S為藍色，硫酚為藍色和紅色。通過藍-綠-紅發(fā)射色組合，可在溶液和活細胞中鑒別檢測Cys/Hcy、GSH/H2S[37]。

1.3 基于CuS沉淀機理的熒光探針

向熒光團引入一個含Cu2+的配位基團后，順磁性的Cu2+金屬中心能夠有效地將熒光基團的熒光淬滅掉。由軟硬酸堿理論，軟堿S2-與交界酸Cu2+有較強的親和力；因此若向該Cu2+配合物中引入H2S，則Cu2+會傾向于生成比配合物更加穩(wěn)定的CuS沉淀(Ksp=1.26×10-36)，從而使得探針主體中的Cu2+被“剔除”，于是熒光得以恢復，就此達成對H2S的識別和檢測。

2018年，尹正日利用香豆素酰肼肟熒光配體合成了一個H2S熒光探針1-Cu2+(圖21)。配體1和Cu2+的配合作用，容易得到配合物1-Cu2+。由于具有順磁效應的Cu2+具有猝滅熒光的特點，1-Cu2+的熒光很弱。Cu2+的脫除可以使得熒光配體的熒光得到恢復，表現(xiàn)出對H2S的熒光增強。此探針對H2S顯示出很高的選擇性。在PBS緩沖溶液中，此探針對H2S的響應時間為5 s，檢測限為37 nmol/L。該探針具有可再生利用和抗干擾的特點，具有很強的實用性[38]。

圖20 探針的識別位點Figure 20 Recognition sites of probe.

圖21 探針的合成Figure 21 Synthesis of probe.

2019年，LIU等人合成一種新型的香豆素熒光探針CMOH(圖22)，用于檢測水介質和活細胞中的Cu2+和S2-。CMOH對Cu2+具有較高的靈敏度和選擇性，探針通過1∶1的結合方式與Cu2+形成非熒光絡合物CMOH-Cu2+。根據(jù)位移法，CMOH-Cu2+的熒光在S2-存在下被恢復，其檢測限為11.4 nmol/L。

這種“開-關-開”過程可在1 min內(nèi)完成，并至少重復5次。此外，CMOH滲透性好，細胞毒性低，可作為檢測生物系統(tǒng)中Cu2+和S2-變化的合適工具[39]。

2019年，YAN等人設計一種基于香豆素的“開-關-開”比色熒光探針L(圖23)，用于連續(xù)識別Cu2+和S2-。該探針對Cu2+和S2-的檢測限分別為2×10-8和6×10-8mol/L。此外，合適的寬pH值(4～10)，表明探針L可以應用于生物檢測，MTT實驗表明探針的細胞毒性可以忽略，在體內(nèi)識別Cu2+和S2-的潛力很大，而且可用于測定A375細胞中的Cu2+和S2-[40]。

圖22 探針的作用機理Figure 22 Mechanism of probe.

圖23 探針的識別位點Figure 23 Recognition sites of probe.

本文從H2S熒光探針的識別機理進行歸納和整理。如表1所示，文獻中報道的大多數(shù)H2S探針不僅可以用于細胞中內(nèi)源性和外源性H2S的檢測，而且還可以用于氣體中檢測H2S。

表1 H2S熒光探針匯總

2 結論和展望

近三年來，熒光探針檢測H2S報道的不少，但基于香豆素熒光團所設計的H2S熒光探針報道的較少，仍然有大量的創(chuàng)新有待研發(fā)。例如，通過在香豆素3、4號位上連接不同的基團用來形成不同的探針，在7號位上連接不同的基團，如羥基，二乙氨基等，這樣香豆素基團3、4或7號位上都能連接不同的基團，可以形成同時檢測兩種物質或者起到協(xié)同作用。已有少數(shù)科研工作者做了一些研究，但更深入的研究仍需要更多的探索。