外周血單個核細胞中NF-κBmRNA表達和血清IL-6水平與TKA術(shù)后DVT的關(guān)系

嚴志強 解緒紅 馮凌思 劉永軼

【摘要】 目的：探討外周血單個核細胞（PBMC）中核因子-κB（NF-κB）mRNA表達和血清白介素-6（IL-6）水平與膝關(guān)節(jié)置換術(shù)（TKA）術(shù)后下肢深靜脈血栓形成（DVT）的關(guān)系。方法：選擇2017年4月-2021年3月在廣東省佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院行TKA的123例患者作為研究對象，術(shù)后根據(jù)彩超診斷結(jié)果判斷是否有血栓形成，分為血栓組和正常組，比較兩組一般資料和PBMC中NF-κB mRNA相對表達量、血清IL-6水平差異。根據(jù)DVT嚴重程度將血栓組分為輕度組、中度組和重度組，比較三組上述各指標差異，分析上述指標和DVT嚴重程度的相關(guān)性。采用多因素logistic回歸分析TKA術(shù)后DVT危險因素。結(jié)果：TKA術(shù)后預防性用藥后21例（17.07%）患者出現(xiàn)DVT，血栓組BMI≥28 kg/m2、術(shù)前診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的比例均顯著高于正常組（P<0.05）。血栓組PBMC中NF-κB mRNA相對表達量和血清IL-6水平均顯著高于正常組，且隨著DVT嚴重程度增加而升高，Spearman相關(guān)分析顯示兩者與DVT嚴重程度均呈正相關(guān)（P<0.05）。多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，BMI、RA、PBMC中NF-κB mRNA相對表達量和血清IL-6水平均是TKA術(shù)后DVT的獨立危險因素（P<0.05）。結(jié)論：PBMC中NF-κB mRNA高表達和血清IL-6水平升高均與TKA術(shù)后DVT有關(guān)。對于肥胖、術(shù)前診斷RA患者行TKA且術(shù)后PBMC中NF-κB mRNA高表達和血清IL-6水平明顯升高者應提早做好預防措施，降低DVT發(fā)生的風險。

【關(guān)鍵詞】 膝關(guān)節(jié)置換術(shù) 下肢深靜脈血栓形成 核因子-κB 白介素-6

[Abstract] Objective： To study the relationship between nuclear factor-κB （NF-κB） mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells （PBMC） and serum interleukin-6 （IL-6） level and deep vein thrombosis （DVT） of lower limbs after knee replacement （TKA）. Method： A total of 123 patients who underwent TKA in Foshan Gaoming District People Hospital from April 2017 to March 2021 were selected as the research objects. After operation， they were divided into thrombus group and normal group according to the results of color Doppler ultrasound diagnosis. The general data， the relative expression of NF-κB mRNA in PBMC and the serum IL-6 level of two groups were compared. According to the severity of DVT， they were divided into mild group， moderate group and severe group. The differences of the above indicators among three groups were compared and the correlation between the above indicators and the severity of DVT was analyzed. Multivariate logistic regression was used to analyze the risk factors of DVT after TKA. Result： DVT occurred in 21 cases （17.07%） after preventive medication after TKA. The BMI≥28 kg/m2 and the proportion of patients diagnosed with rheumatoid arthritis （RA） before operation in thrombus group were significantly higher than those in normal group （P<0.05）. The relative expression of NF-κB mRNA in PBMC and the serum IL-6 level in thrombus group were significantly higher than those in normal group， and increased with the increase of DVT severity. Spearman correlation analysis showed that both of them were positively correlated with DVT severity （P<0.05）. The multivariate logistic regression analysis showed that BMI， RA， the relative expression of NF-κB mRNA in PBMC and serum IL-6 level were independent risk factors of DVT after TKA （P<0.05）. Conclusion： The high expression of NF-κB mRNA in PBMC and the increase of serum IL-6 level are related to DVT after TKA. For obesity， those patients with RA diagnosed by TKA before operation， those NF-κB mRNA expression in PBMC and serum IL-6 level increased significantly after operation， should take preventive measures in advance to reduce the risk of DVT.

[Key words] Total knee arthroplasty Deep venous thrombosis of lower limbs Nuclear factor-κB Interleukin-6

First-authors address： Foshan Gaoming District Peoples Hospital， Foshan 528500， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.18.001

全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)（TKA）對多種膝關(guān)節(jié)疾病終末期的治療效果顯著。隨著我國老齡化加劇，手術(shù)量逐年遞增，其相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率亦逐年增加，其中下肢深靜脈血栓形成（DVT）是術(shù)后常見并發(fā)癥之一，也是導致肺栓塞（PE）甚至死亡的主要原因[1]。目前，較多學者對TKA術(shù)后并發(fā)DVT的危險因素和發(fā)病機制進行研究，但尚未形成統(tǒng)一定論[2]。早期對DVT進行監(jiān)測、評估并及時處理非常重要。有研究表明，外周血炎癥細胞因子水平及其上游基因參與DVT形成[3-6]。核因子-κB（NF-κB）是控制DNA轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)炎癥反應及免疫應答的核心轉(zhuǎn)錄因子，可啟動多種炎癥基因的表達，其可能促進血小板活化、聚集等過程，參與DVT形成[7-8]。本研究通過檢測TKA術(shù)后DVT患者外周血單個核細胞（PBMC）中NF-κB mRNA相對表達量和血清白介素-6（IL-6）水平，以觀察兩者與TKA術(shù)后DVT形成的關(guān)系。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年4月-2021年3月在廣東省佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院行TKA的123例患者的臨床資料。納入標準：年齡60～80歲;具有全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)適應證，無明顯手術(shù)禁忌證;彩超診斷DVT標準以及DVT嚴重程度評定標準，可參照張永剛等[9]和何菊梅等[10]方法，術(shù)后進行分組;患者知情同意，依從性好，能全程配合彩超檢查及抽血檢測。排除標準：合并心、肝、腎等重要臟器損傷;合并充血性心力衰竭、靜脈曲張、囊性纖維化、敗血癥、全身感染、癌癥、炎癥性腸病和狼瘡等疾病;長期吃激素、抗凝藥、非固醇類藥物;近3個月內(nèi)進行關(guān)節(jié)翻修手術(shù)或血管手術(shù)。術(shù)后根據(jù)彩超診斷結(jié)果判斷是否有血栓形成將患者分為血栓組（n=21）和正常組（n=102）。本研究通過本院倫理委員會批準（批準編號：2018117），患者和家屬已知情同意并同意簽署告知書。

1.2 方法 所有患者術(shù)前及術(shù)后1、3 d，采集空腹靜脈血3 mL，EDTA抗凝，4 000 r/min離心10 min，取上層血清凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｍㄟ^ELASA法檢測血清中IL-6濃度。另外相同時間相同方法采集3 mL置入EDTA抗凝管，采用Ficoll密度梯度離心法提取外周血PBMC，分離出PBMC后置冰箱保存待用。采用RT-qPCR檢測PBMC中NF-κB mRNA表達量。具體方法如下：無菌條件下抽提PBMC總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。引物序列：NF-κB，F(xiàn)orward：5-GCGAGAGGAGCACAGATACC-3，Reverse：5-GGGGTTGTTTGTTGGTCTGGA-3;β-actin，F(xiàn)orward：5-GTGACGTGGACATCCGCAAAG-3，Reverse：5-GGAAGGTGGACAGCGAGGC-3。RT-qPCR反應體系20 μL，包括cDNA 0.5μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，Nuclear-free水補足至20 μL。在熒光定量PCR儀上（美國ABI公司）進行擴增，設置條件參數(shù)：95 ℃預變性1 min、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、60 ℃延伸30 s、40個循環(huán)重復。復3孔，計算平均Ct值。相對表達量采用2-ΔΔCt方法，即血栓組ΔCt=血栓組[目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值];正常組ΔCt=正常組[目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值];ΔΔCt=血栓組ΔCt-正常組ΔCt。

1.3 觀察指標 比較兩組性別、年齡、體重指數(shù)（BMI）、是否合并高血壓、是否合并糖尿病、術(shù)前是否診斷為RA。比較兩組PBMC中NF-κB mRNA相對表達量（最后用于統(tǒng)計的數(shù)據(jù)為術(shù)前和術(shù)后1、3 d三次數(shù)值取平均數(shù)）和血清IL-6濃度（數(shù)據(jù)處理同NF-κB mRNA相對表達量）差異，比較血栓輕度組、中度組和重度組三組上述各指標差異，分析上述指標與DVT嚴重程度的相關(guān)性。采用多因素logistic回歸分析TKA術(shù)后DVT的危險因素。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。正態(tài)分布的計量資料采用（x±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，三組比較采用隨機區(qū)組設計的方差分析，并采用SNK法進行組間兩兩比較。計數(shù)資料以率（%）表示，兩組比較采用字2檢驗。采用Spearman進行相關(guān)性分析，采用多因素logistic回歸分析TKA術(shù)后DVT危險因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 納入的123例患者，男66例，女57例;年齡60～80歲，平均（71.34±7.66）歲。TKA術(shù)后預防性用藥后，共21例（17.07%）患者出現(xiàn)DVT，其中，輕度血栓12例，中度血栓5例，重度血栓4例。兩組性別、年齡、高血壓、糖尿病比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;血栓組BMI≥28 kg/m2、RA的比例均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 兩組各觀察指標比較 血栓組PBMC中NF-κB mRNA相對表達量和血清IL-6水平均顯著高于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 不同程度血栓組各觀察指標比較 兩個指標均隨著DVT嚴重程度增加而升高，即重度組>中度組>輕度組，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

2.4 各觀察指標與DVT嚴重程度的相關(guān)性分析 采用Spearman相關(guān)分析顯示，PBMC中NF-κB mRNA相對表達量、血清IL-6水平與DVT嚴重程度均呈正相關(guān)（rs=0.421、0.621，P=0.000）。

2.5 危險因素分析 以BMI、RA、PBMC中NF-κB mRNA相對表達量和血清IL-6水平作為自變量，賦值BMI<28 kg/m2為0，BMI≥28 kg/m2為1，賦值術(shù)前診斷非RA為0，術(shù)前診斷RA為1，PBMC中NF-κB mRNA相對表達量和血清IL-6水平均為原始數(shù)據(jù)，以TKA術(shù)后是否發(fā)生DVT作為因變量，進行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示BMI、RA、NF-κB和IL-6均是TKA術(shù)后發(fā)生DVT的獨立危險因素，見表4。

3 討論

DVT是指在人體深靜脈中形成血凝塊，導致深靜脈回流受阻，是靜脈血栓栓塞性疾病之一，最常出現(xiàn)部位為腿部或骨盆的大靜脈，表現(xiàn)為單側(cè)腿部疼痛、發(fā)紅和腫脹，嚴重者與PE和血栓形成后綜合征（PTS）密切相關(guān)，兩者被認為是TKA術(shù)后導致死亡和增加醫(yī)療費用的主要原因[11-13]。目前DVT的發(fā)病機制尚未統(tǒng)一定論。有學者提出三聯(lián)起因，即靜脈淤滯、血液高凝性和血管壁損傷[4]。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明炎癥反應可能導致DVT[2，14-15]。文獻[16-18]報道許多危險因素可能導致DVT，如手術(shù)、肥胖、癌癥、RA、炎癥性腸病等可能通過炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)血栓形成。不同于其他血栓形成的創(chuàng)傷機制，包括血管橫斷和隨后暴露于內(nèi)皮下膠原蛋白和其他促凝細胞外基質(zhì)材料，血管壁的炎癥可能引發(fā)完整靜脈血栓形成，激活內(nèi)皮細胞、血小板和白細胞，隨后形成微粒，可通過誘導組織因子來觸發(fā)凝血系統(tǒng)[2，4]。研究表明TKA術(shù)后采取預防性用藥的前提下DVT的發(fā)生率低于30%[4]。本研究結(jié)果顯示，TKA術(shù)后預防性用藥DVT發(fā)生率為17.07%，血栓組肥胖（BMI≥28 kg/m2）、術(shù)前診斷為RA的比例均高于正常組（P<0.05），符合上述研究結(jié)論，可能原因在于肥胖會導致凝血系統(tǒng)加強和纖溶活性下降，RA患者全身炎癥反應，均可通過炎癥反應導致DVT。

研究證實，血栓發(fā)生與NF-κB信號通路的激活密切相關(guān)[3，7]。NF-κB是炎癥和免疫穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，通過轉(zhuǎn)錄控制大量重要的促炎因子和抗炎因子來達到這一穩(wěn)態(tài)。在促炎反面，NF-κB可誘導許多促炎因子（如IL-6等）和趨化因子等炎性靶基因的過度持續(xù)表達，驅(qū)化大量炎性細胞浸潤，最終造成炎癥反應，反過來，這些細胞因子又進一步活化NF-κB，造成持續(xù)放大的炎癥反應[8，19]。Cheng等[20]研究顯示DVT大鼠血栓和炎癥反應加重可能與TLR-4/NF-κB炎癥信號通路的激活有關(guān);葉柳青等[21]發(fā)現(xiàn)孕鼠DVT血管內(nèi)皮細胞中NF-κB明顯激活。IL-6由多種免疫細胞產(chǎn)生，被稱為“前炎癥細胞因子”，在全身應激反應、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應中具有重要作用，可活化中性粒細胞，刺激肝臟合成急性反應期血漿蛋白，是急性炎癥反應最主要的細胞因子[22]。研究報道IL-6表達升高與DVT的形成有關(guān)[4];DVT患者血清IL-6水平顯著升高，經(jīng)藥物干預后明顯下降[23]。Du等[24]研究發(fā)現(xiàn)腹部惡性腫瘤術(shù)后DVT患者IL-6、NF-κB水平顯著高于無DVT者。本研究結(jié)果顯示，血栓組PBMC中NF-κB mRNA相對表達量和血清IL-6水平均顯著高于正常組（P<0.05），且兩個指標均隨著DVT嚴重程度增加而升高，表明TKA術(shù)后DVT患者PBMC中NF-κB mRNA高表達和血清IL-6水平升高與血栓形成相關(guān)，提示兩者可作為評估TKA術(shù)后DVT嚴重程度的指標。

張永剛等[9]研究發(fā)現(xiàn)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后DVT患者血清細胞因子水平顯著高于正常組，且與DVT嚴重程度呈正相關(guān)。本研究Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，PBMC中NF-κB mRNA相對表達量和血清IL-6水平與TKA術(shù)后DVT嚴重程度均呈正相關(guān)，表明隨著NF-κB表達和IL-6水平升高，血栓嚴重程度逐漸升高。可以根據(jù)NF-κB表達和IL-6水平高低對DVT嚴重程度進行初步評估。筆者進一步采用多因素logistic回歸分析TKA術(shù)后DVT的危險因素，結(jié)果顯示BMI、RA、PBMC中NF-κB mRNA相對表達量和血清IL-6水平均是TKA術(shù)后發(fā)生DVT的獨立危險因素。因此，筆者認為，對于肥胖、術(shù)前診斷RA患者行TKA且術(shù)后PBMC中NF-κB mRNA高表達和血清IL-6水平明顯升高者應提前做好預防措施，以降低DVT發(fā)生的風險。

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（收稿日期：2021-05-06） （本文編輯：程旭然）