支氣管哮喘分期對誘導痰IL-4水平及炎癥細胞分型的影響研究

劉慧，許碩，徐玉輝

(贛州市人民醫院呼吸科，江西 贛州 341000)

0 引言

支氣管哮喘是由多種細胞，如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等，及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。氣道炎癥機制在支氣管哮喘的發病發展過程中起重要作用，目前認為活化的Th2 產生的白介素IL 如IL-4、IL-5 及IL-13 等參與氣道的炎癥過程，同時IL 等細胞因子也可直接激活嗜酸性粒細胞、肥大細胞等使氣道呈現高反應狀態[1,2]。本研究通過檢測支氣管哮喘患者誘導痰炎癥細胞分型及IL-4 的水平，探討誘導痰技術對支氣管哮喘的診斷及分期意義，同時進一步研究IL-4 在支氣管哮喘的慢性炎癥過程中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象分為三組：支氣管哮喘急性發作組，支氣管哮喘穩定組，健康對照組。哮喘患者均符合2016 年中華醫學會呼吸病學分會制定的哮喘防治指南[3]的診斷標準，已通過倫理委員會并簽署知情同意書。急性發作組為2019 年1 月至2019 年10 月就診于我院呼吸內科門診，既往診斷支氣管哮喘，長期規律吸入表面激素治療，近期因喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀再次發生或癥狀加重，需調整藥物于我院就診的患者，標本均在調整藥物治療前采集；穩定組為同期就診于我院門診診斷為支氣管哮喘，長期規律吸入表面激素治療，近兩個月內未有急性發作或全身使用激素的患者；健康對照組為同期于我院體檢中心體檢，年齡，性別，吸煙史相匹配，胸片，肺通氣功能檢查正常的人員。排除標準：(1)研究對象排除慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張、間質性肺疾病、肺結核等慢性肺部疾病，且無肺心病以外的其他嚴重心臟病病史，無嚴重肝、腎疾患及惡性腫瘤病史，無自身免疫性疾病、活動性風濕疾病、結締組織病、肝炎、HIV感染等疾病。(2)研究對象排除不適宜行誘導痰檢查的患者：近期有呼吸道感染、咯血等患者(＜4 周)。(3)研究對象需排除無法簽署知情同意書及無法配合的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 誘導痰的收集與處理

誘導痰的所有標本均采集于調整藥物之前，并要求患者行口腔清潔。受試者給予吸入沙丁胺醇氣霧劑200μg，15 分鐘之后使用超聲霧化器，將5%的高滲鹽水持續霧化吸入2 分鐘后，再次進行口腔清潔，繼續霧化10-15 分鐘后鼓勵患者進行深部咳嗽，咳出痰液并收集至少1g 以上。若出現無痰或者痰量不夠的情況，每5 分鐘持續霧化1 次，總霧化時間不超過30 分鐘。痰液收集后2h 內進行處理，挑取粘稠膠凍樣的部分移至15mL無菌離心管中，稱取痰液質量后，加入4 倍體積的0.1% 1,4-二硫蘇糖醇(DTT)，在室溫下震蕩30-60 分鐘混勻。37℃水浴箱孵育30 分鐘，300 目篩網進行過濾，收集濾液后進行1500rpm/min 的速度離心10 分鐘。上清液收集15mL 無菌離心管中保存至-80℃冰箱留作IL-4 測定。離心后的細胞用PBS 重懸吹打。細胞懸液使用2%臺盼藍測定細胞活力，若細胞存活率＞50%且鱗狀上皮細胞百分比＜20%則為合格標本，可進行下一步檢測。

1.2.2 誘導痰細胞分類計數

取離心后細胞沉淀進行痰細胞涂片，自然風干，固定，HE 染色，晾干后用中性樹脂封片。在光學顯微鏡下進行細胞計數及分類，計數400 個非鱗狀上皮細胞，分別計數中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞，并計算各種炎癥細胞所占的百分比。

1.2.3 ELISA 法檢測誘導痰中IL-4 水平

采用酶聯免疫吸附法( ELISA) 測定誘導痰上清液中IL-4的濃度，操作嚴格按照ELISA 試劑盒(美國RD 公司)說明書進行，酶標儀檢測IL-4 水平。

1.2.4 肺功能檢測于我院肺功能室使用Jaeger 公司的MASTER SCREEN 系列肺功能儀測定。

1.3 統計學分析

連續型變量數據以均數±標準差表示，數據均進行正態性檢驗及方差齊性檢驗，多組比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)，兩兩比較方差齊者采用LSD，方差不齊者，采用Welch 校正法，組間兩兩比較采用Dunnett，s T3 法。性別分布采用RxC 資料的卡方檢驗。相關分析采用Pearson(正態分布資料)或Spearman(非正態分布資料)相關。用SPSS 23.0 統計軟件分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般情況

三組患者在年齡、性別分布、肺功能指標(FEV1%)上均無統計學差異(P＞0.05)，具有可比性。見表1。

表1 入組患者一般情況

2.2 各組誘導痰炎癥細胞百分比

中性粒細胞在急性發作組明顯高于穩定組及對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；嗜酸性粒細胞在急性發作組明顯高于穩定組及對照組，穩定組高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；巨噬細胞在急性發作組明顯低于穩定組及對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；淋巴細胞在三組間無統計學差異(P＞0.05)。見表2。

表2 各組誘導痰炎癥細胞百分比

2.3 各組誘導痰IL-4 水平

誘導痰中IL-4 水平，急性發作組與穩定組較對照組升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；急性發作組與穩定組之間IL-4 水平差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 各組誘導痰IL-4 水平

2.4 相關性分析

支氣管哮喘急性發作組的誘導痰中IL-4 與嗜酸性粒細胞百分比呈正相關(r=0.6，P＜0.05)；支氣管哮喘穩定組的誘導痰IL-4 與嗜酸性粒細胞百分比不相關(r=0.1，P＞0.05)。見圖2。

3 討論

圖2 急性發作組（左）及穩定組（右）IL-4 與嗜酸性細胞相關性分析

支氣管哮喘發病機制目前尚未完全明確，但氣道慢性炎癥在其中占有重要作用。誘導痰技術作為鑒別慢性咳嗽病因，越來越受到重視。本研究發現支氣管哮喘患者誘導痰中嗜酸性粒細胞百分比明顯高于對照組，與既往的研究[4]相一致。本研究結合支氣管哮喘的分期研究發現，嗜酸性粒細胞及中性粒細胞在急性發作組明顯高于對照組。Demarche 等[5]的研究發現，嗜酸性粒細胞與中性粒細胞在哮喘患者中的升高可能與不同的支氣管哮喘表型有關，并且與急性發作過程中合并的上呼吸道感染相關，目前尚無統一定論。

IL-4 在支氣管哮喘患者的誘導痰中較對照組明顯升高。Punia 等[6]及Michaud 等[7]的研究表明，IL-4 與IL-13 在哮喘患者呼吸道炎癥過程及氣道重塑過程中起重要作用，與本研究結果相符。針對于IL-4 與哮喘之間的研究多見于循環系統或支氣管肺泡灌洗液，雖然均提示IL-4 與哮喘的密切關聯，但誘導痰中IL-4 研究尚不多見。2012 年一項針對兒童咳嗽變異性哮喘的研究發現誘導痰中IL-4 蛋白及mRNA 的升高，與本研究相一致[8]，提示誘導痰中IL-4 的水平可能對支氣管哮喘的診斷有重要意義。更有研究針對Th2 細胞因子IL-4 的生物治療[1,9]及IL-4 受體的多態性研究[10]，提示IL-4 作為哮喘發病的重要機制，未來可能作為新的有效治療靶點。

而徐友文等[11]的研究證實，輕中重組哮喘兒童血中的IL-4 明顯高于對照組，但各組之間差異并無統計學意義，并在布地奈德霧化吸入治療后IL-4 水平明顯下降，與本研究相一致。本研究發現哮喘患者急性發作組與穩定組之間IL-4 水平差異無統計學意義，提示IL-4 在支氣管哮喘的發病過程起重要作用，但與哮喘的控制情況可能無明顯關聯。

支氣管哮喘急性發作的患者誘導痰IL-4 與嗜酸性粒細胞呈正相關。有研究發現嗜酸性粒細胞與IL-4 在兒童氣道高反應性的發展中起到關鍵作用；也有要就發現哮喘誘導痰嗜酸性粒細胞與FENO 呈正相關[12]，但IL-4 與嗜酸性粒細胞的研究尚不多見。而王茂[13]等的針對支氣管哮喘的孕婦的研究發現，具有支氣管哮喘遺傳背景的新生兒臍血嗜堿性粒細胞表達IL-4mRNA 和釋放IL-4 的水平，哮喘組顯著高于對照組，其釋放的IL-4 在支氣管哮喘發病中起到重要作用。IL-4 在支氣管哮喘發病機制中的重要作用毋庸置疑，但針對IL-4 與嗜酸性粒細胞的具體關聯仍需進一步研究。

誘導痰炎癥細胞分型對支氣管哮喘的診斷與分期有重要意義，對于臨床鑒別慢性咳嗽的病因有重要作用。IL-4 作為支氣管哮喘發病機制的重要部分，可能與激活或者募集嗜酸性粒細胞，導致氣道高反應性相關。本研究局限于誘導痰中IL-4的研究，未涉及循環系統中IL-4 的改變及IL-4 與嗜酸性粒細胞之間的具體關聯為本研究的不足，進一步的分子實驗將繼續探討IL-4 與嗜酸性粒細胞在支氣管哮喘中的固體機制。