腦缺血/再灌注損傷后線粒體結構與功能穩態失衡機制的研究進展

吳 丹 漆仲文 張 偉 馬 妍

1.天津中醫藥大學研究生院，天津 301617；2.天津中醫藥大學第二附屬醫院腦病科，天津 300151

腦卒中具有高致死率、高致殘率、低治愈率的特點，預計到2030 年，腦卒中患病人數將繼續上升到7700 萬，造成更多的經濟和社會負擔[1-2]。腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中發病率占腦卒中總數的70%～80%[3]，遠高于出血性腦卒中。靜脈溶栓是目前治療急性缺血性腦卒中的重要內科治療手段[4]，但因治療時間窗及應用風險等原因，其在臨床應用受到限制。諸多研究表明，線粒體結構完整性及其功能穩態平衡的破壞是缺血性腦卒中主要病理環節之一[5]。缺血性腦卒中首先表現為腦缺血損傷[6]，再灌注對于保護受損腦組織是必不可少的，但恢復血流后腦缺血/再灌注損傷也是不可避免的[7]。腦缺血/再灌注損傷主要包括鈣超載、氧化應激及線粒體功能紊亂等環節[8]。線粒體是一種半自主細胞器，不僅在能量代謝中發揮重要作用，而且在控制細胞存亡的過程中也扮演著重要角色，腦缺血/再灌注損傷后細胞凋亡的發生主要取決于線粒體[5]。近年來，有關腦缺血/再灌注損傷后線粒體結構及功能變化研究取得了一定進展，對促進缺血性腦損傷神經元保護具有較大意義。本文對腦缺血/再灌注損傷后線粒體結構與功能穩態失衡的研究進展進行論述，旨在為臨床及實驗研究提供參考。

1 線粒體與腦缺血/再灌注損傷

線粒體是細胞鈣穩態調節的主要結構，細胞鈣超載可導致氧化應激，產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮，其中以線粒體內ROS 大量生成為主[9-10]。線粒體膜通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是ROS 依賴的位于線粒體內外膜之間的一組蛋白復合體，線粒體內鈣超載及氧化應激可通過脂質過氧化、損傷線粒體呼吸鏈等導致mPTP 的大量開放，進而使線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C 等[11]。細胞色素C 為位于線粒體內膜的小分子蛋白，它作為線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ和復合物Ⅳ之間的電子載體，其釋放可活化Caspase-9，繼而活化凋亡執行蛋白Caspase-3，最終導致神經元凋亡[8]。可見線粒體結構完整性及其功能穩態平衡的破壞是腦缺血/再灌注損傷的關鍵環節，保護線粒體結構和功能是腦缺血/再灌注損傷后神經元保護的重點。

2 腦缺血/再灌注損傷后線粒體穩態失衡的機制

2.1 氧化應激

氧化應激是腦缺血主要有害因素之一。正常生理條件下適量ROS 在一些重要生理過程中起關鍵作用，它可以被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶和如谷胱甘肽等抗氧化劑迅速清除[12]。腦缺血時引起的線粒體呼吸鏈功能障礙在細胞中產生氧化應激，對線粒體功能穩態及防御造成巨大影響，使其無法正常清除氧自由基而導致細胞死亡。腦缺血后線粒體中氧氣減少，限制氧化磷酸化，ATP 生成減少，導致電子傳輸鏈釋放氧自由基，并在線粒體中產生大量ROS；而在再灌注過程中，供氧恢復后，促氧化劑酶系統和線粒體利用氧氣作為底物產生大量氧自由基，在細胞中產生大量ROS 并最終觸發從細胞信號通路改變到細胞死亡一系列過程[13]。所以線粒體是細胞內ROS 的主要貢獻者，通過氧化磷酸化和其他酶反應將分子氧轉化為SOD 和過氧化氫。電子傳輸鏈是超氧化物的主要來源，線粒體在氧化磷酸化過程中通過細胞色素C 氧化酶將氧氣還原成水。

此外，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）也被認為是腦缺血后ROS 形成的來源之一。NOX 作為一種促氧化酶，缺血會誘導其激活，加劇腦組織氧化應激；而ROS 對缺氧條件敏感，腦血流再灌注后缺氧誘導因子會誘導NOX 產生更大量的ROS[14]。再灌注期間SOD 等內源性抗氧化酶表達降低，無法進行有效氧化清除工作，不能有效阻止氧化劑介導的腦損傷，導致缺血后的線粒體功能障礙及隨后的細胞凋亡[15]。

2.2 線粒體通透性轉換孔

mPTP 是控制線粒體基質和細胞質間分子交換的調節孔，由三種蛋白質組成：線粒體外膜（outer mitochondrial membrane，OMM）中的電壓依賴性陰離子通道、線粒體內膜（inner mitochondrial membrane，IMM）中的腺嘌呤核苷酸轉位酶及線粒體基質中的親環素D（cyclophilin D，CypD）[16]，其中CypD 對mPTP 的調節最為關鍵，是參與神經元缺血性死亡的重要部分。正常情況下mPTP 處于關閉狀態，IMM 選擇性地使小分子代謝底物與離子通過，當細胞發生氧化應激，基質內Ca2+濃度升高，IMM 特異性孔位開放，mPTP 通透性增加，使大量小分子物質及帶電離子如ROS 等進入胞內，造成線粒體損傷，同時將細胞色素C、絲氨酸蛋白酶等從線粒體釋放到胞漿中，細胞色素C 與胞漿中促凋亡激活因子Apaf1 結合，觸發Caspase 級聯效應，激活Caspase-3，導致神經元細胞死亡[17]。臨床上多使用CypD 抑制劑環孢菌素進行干預，但因其毒性和免疫抑制作用在應用時受到限制[18]。

2.3 鈣超載

正常情況下細胞內Ca2+主要分布于線粒體及肌漿網中。腦缺血時腦血流中斷，供氧減少，大腦在缺氧狀態下ATP 生成減少，線粒體功能障礙，使Na+/K+/ATP 酶等離子通道無法維持正常的電化學梯度，導致膠質細胞和神經細胞持續去極化[19]，致使電壓門控通道持續開放，細胞內濃度升高；細胞外基質內谷氨酸因再攝取而蓄積，過量的谷氨酸與突觸后神經元上N-甲基-D-天冬氨酸和腺苷酸等離子受體結合，引起Ca2+大量內流，造成興奮性毒性。持續的Ca2+內流導致磷脂酶和蛋白酶的激活，誘導ROS 的生成、細胞膜破壞，細胞外液進入細胞內部，導致細胞毒性水腫并最終造成細胞壞死[20]。在缺血期和再灌注期，Ca2+超載使超氧陰離子自由基及其他氧自由基升高，Ca2+超載僅是觸發因素，而后續L 型鈣通道的持續下調可能是遲發性神經元死亡的原因之一[21]。

2.4 線粒體自噬

線粒體動力學（線粒體分裂、線粒體融合和線粒體自噬）在線粒體穩態調控中起關鍵作用，調節線粒體動力學的機制與線粒體自噬的啟動密切相關[22]，機體可選擇性通過自噬消除受損線粒體，恢復線粒體功能穩態[23]。細胞凋亡或饑餓時，線粒體通過有絲分裂進行降解與再循環，這是線粒體自噬的特殊形式，可分為泛素依賴途徑和受體依賴途徑[24]。

泛素依賴途徑通過線粒體泛素化，使受損線粒體被吞噬并通過溶酶體降解去除。目前該途徑研究重點集中在調節PINK1/Parkin 通路上。線粒體損傷導致線粒體膜電位破壞，使PINK1 在OMM 表面堆積，進行PINK1 招募并激活磷酸化PINK1 泛素樣域中的Parkin，使其聚集到受損的線粒體中[25-26]。Parkin 激活導致OMM 上的駐留蛋白發生泛素化級聯效應，線粒體表面泛素信號增加，激活泛素-蛋白酶體系統降解OMM 蛋白及自噬受體蛋白，使自噬細胞發育[27]。自噬由一組被稱為自噬相關（autophagy-related gene，Atg）蛋白的核心蛋白驅動，Atg 蛋白控制自噬體的啟動，隨后展開其雙膜結構包裹溶酶體降解所用的細胞質內容物[28]。此外，有研究表示作用于上游或獨立于PINK1激活的泛素特異性蛋白酶30，能通過去泛素化OMM蛋白與調節神經元中的PINK1/Parkin 通路，起到適度有絲分裂及吞噬作用[29]。

受體依賴途徑主要通過腺病毒E1B 相互作用蛋白3（Bcl2/adenovirus E1B19kDa interacting protein 3，BNIP3）/NIP 樣蛋白X（NIP-like protein X，NIX）信號通路實現，Bcl2/BNIP3 和NIX 的相互作用蛋白被認為參與了缺氧誘導的有絲分裂。早期對這些蛋白作用的研究主要集中在細胞凋亡上，NIX 與BNIP3 有約50%的同源性，兩者均位于OMM 上，含有一個非典型的Bcl2 同源3 結構域，并且具有主要的細胞質N-末端[30-31]。NIX 是一種自噬受體，在線粒體損傷后和紅細胞分化過程中介導線粒體清除。當線粒體受到壓迫時，NIX 和微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）的相互作用增加，靶向線粒體進入自噬體降解[32]。過去對BNIP3 研究主要針對其激活Bax 或Bak 細胞介導線粒體功能障礙方面[33]。近期研究發現BNIP3 具有激活線粒體自噬和誘導死亡的功能，參與線粒體自噬的多個調控過程[34]。BNIP3 過表達誘導廣泛自噬，其中線粒體被認定為“貨物”，當被缺氧情況或羰基氰化物間氯苯腙激活時，BNIP3 表達量增加，BNIP3 二聚化導致LC3B 募集，從而促進選擇性線粒體清除，實現自噬[35]。

腦缺血/再灌注后造成腦內缺氧環境，致使線粒體無法正常合成ATP，與此同時線粒體膜電位下降，為維持線粒體膜電位穩定，線粒體消耗ATP 大幅增加。細胞內ATP 濃度降低與AMP 因能量損耗而減少使AMP 活化蛋白激酶活性增強，其激活抑制mTOR 活性，從而上調自噬[36]。此外，在腦缺血后的再灌注時期，受之前缺血缺氧影響，腦神經元中的線粒體結構與功能穩態失衡，所以當血流再灌注時，所帶來的氧氣除為細胞供能外，也同時產生了大量ROS。過量的ROS 直接損傷線粒體，使線粒體應對氧化應激的能力減低，影響細胞氧化還原穩態，且能開放mPTP，導致線粒體腫脹，啟動線粒體自噬[37]。缺血/再灌注發生后不僅細胞能量缺失，ATP 通道受損，細胞內Ca2+也隨之升高，線粒體吸收Ca2+濃度增加，從而影響線粒體代謝，造成線粒體腫脹、崩解，促進細胞色素C 釋放，最終導致細胞凋亡，所以啟動線粒體自噬清除受損線粒體以保護神經細胞[38]。但目前對于線粒體自噬在腦缺血/再灌注中發揮的作用還沒有統一答案，綜合近期多數研究還是表明線粒體自噬過程對于腦缺血/再灌注損傷，在一定程度上具有神經保護作用[39-41]。

3 小結

腦卒中是一個復雜的病理生理過程，恢復血流后的腦缺血/再灌注損傷不可避免。線粒體不僅在能量代謝中起關鍵作用，而且對神經元細胞凋亡也有重要影響。腦缺血后失血失氧狀態會導致線粒體功能穩態失衡。過量ROS 產生的氧化應激導致線粒體結構和功能的損傷，細胞抗氧化能力失常，無法清除自由基而致細胞死亡。線粒體內鈣超載以及氧化應激可通過脂質過氧化、損傷線粒體呼吸鏈等導致mPTP 的大量開放，使線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C 等物質，繼而活化Caspase-9，并向下活化凋亡執行蛋白Caspase-3，最終導致神經元凋亡。腦缺血/再灌注損傷后，Ca2+的大量內流導致鈣超載，而鈣超載是導致細胞死亡的重要因素。機體在腦缺血后可選擇性通過自噬的受體依賴途徑及泛素依賴途徑消除受損線粒體，使其恢復功能穩態。因此保護線粒體結構和功能是腦缺血/再灌注損傷后神經元保護的重點。但對其作用機制間的相互作用及有效干預措施的研究尚不完善，相信隨著對腦缺血/再灌注損傷后線粒體結構與功能穩態失衡研究的不斷深入，以線粒體為作用重點的治療方法將為腦卒中的發生、發展提供新的防治思路及方法。