PI3K/AKT通路與骨質疏松癥的關系及中醫藥干預的研究進展

林德民 謝興文 李寧 徐世紅 李鼎鵬 柳博 姜朝陽 趙建偉

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

2.西北民族大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000

3.甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 7300004

4.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000

5.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)，是臨床常見的一種骨代謝疾病，其發病機制與破骨細胞(osteoclast，OC)及成骨細胞(osteoblast，OB)共同影響并介導的“骨平衡”失衡關系密切。大量研究表明，PI3K/AKT通路能調控相關細胞，引起“骨平衡”偏移。中醫藥治療OP由來已久，在治療不同類型OP中都有明確效果。部分研究提出，中醫藥干預能明顯影響PI3K/ AKT通路相關蛋白表達，這也許是中醫干預治療OP的重要機制之一。

1 PI3K/AKT信號通路

1.1 PI3K/AKT信號通路的組成

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)，是一種位于胞質的脂質激酶，由調節亞單位P85(一個相對分子質量為 85 ×103)和催化亞單位P110(相對分子質量為110 ×103)的異源二聚體所構成，共有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三種類型。PI3K兼具絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)和磷酯酰肌醇激酶雙重活性，并在細胞膜大范圍的信號轉導、膜轉運和代謝過程中起著關鍵調節作用[1-2]。當前研究發現，PI3K所合成的活化后產物磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)在接受特定的刺激并作為“第二信使”調控細胞生命活動中具有關鍵作用[3]。

絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)，即AKT蛋白，亦名蛋白激酶(protein kinase，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(有480個氨基酸殘基)。結構分析可以發現，AKT結構上分為PH結構域、催化域及調節域共3部分；其中，PH結構域與蛋白激酶A、蛋白激酶C相似并高度保守[1]。當AKT蛋白未活化，PH結構域遮蓋活性區域；活化時，該結構域與PIP3結合，影響下游信號分子，參與并調控細胞的相關生命活動[4-5]。

1.2 PI3K/AKT通路激活

1.2.1激活過程：位于胞膜附近的PI3K可被膜上受體酪氨酸激酶(RTKs)、脾酪氨酸激酶(SYK)、d大鼠肉瘤蛋白(RAS)、G蛋白耦連受體(GPCRs)、JAK激酶(Janus kinase)等激活[6]。上游信號分子刺激后，處于胞質區位置自身磷酸化的酪氨酸殘基與P110結合，PI3K被募集至質膜，P85進入質膜內表面，磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸(PIP2)磷酸化后與P110結合，大量磷酸酰肌醇-3-磷酸(PI3P)及磷酸酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PI-3,4,5- P3)，磷酸酰肌醇-3,4-二磷酸(PI-3,4- P2)形成。下游信號分子AKT/ PKB結合后將從胞漿轉移到質膜上，其構象則會發生變化，即PH結構域對其催化活性部位的抑制解除，從而激活AKT/ PKB的激酶活性[7-8]。

1.2.2PI3K/AKT通路對成骨細胞的影響：OB起源自間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，在參與調節骨形成過程中起重要作用。大量文獻研究指出，雄激素、鋅、N-鈣黏著蛋白骨形態發生蛋白2、4、7、9及其亞家族成員等，都能夠通過PI3K/ AKT通路促進OB增殖、分化。Huang等[9]研究指出，PI3K/ AKT在加快OB增殖同時，也可以通過Wnt/β-catenin、生長激素/胰島素樣生長因子1等多種途徑，促進OB增殖分化。有研究[10]發現，激活的PI3K能夠調節p53、cyclin D1及caspase-3/9蛋白的水平，降低PSMC6誘導的OB凋亡，促進細胞增殖。Pan等[11]實驗數據揭示，PI3K/ AKT通路參與糖皮質激素(glucocorticoids，GCs)誘導OB成骨抑制的過程并在其中起到一定作用。同時，PI3K/Akt/mTOR通路在原硅酸介導的體外成骨過程中也起著積極的調節作用[12]。另有國內學者[13]發現，脈沖電磁場(pulse electromagnetic fields，PEMF)可通過OB表面初級纖毛激活PI3K /AKT通路，促進骨形成活性。

1.2.3PI3K/AKT通路對破骨細胞的影響：OC起源自骨髓造血干細胞，直接參與骨吸收過程。大量研究表明，PI3K/AKT通路與OC間存有重要聯系。PI3K/ AKT通路可通過影響巨噬細胞集落刺激因子受體(M-CSF)及核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)，在OC存活、分化以及“骨平衡”中產生影響[14]。當PI3K/AKT通路被抑制時OC的形成減少。動物實驗證明，PI3K抑制劑LY294002能明顯抑制磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)磨損顆粒介導的小鼠顱骨溶解和OC形成，BMD值增加[15]。miR-363-3p[16]、腫瘤壞死因子α及炎癥因子等信號能夠通過PI3K/AKT途徑，直接或間接促進OC生成，影響OP的發病。

2 中醫藥干預PI3K/AKT通路

2.1 中藥單體

大量研究文獻指出，中藥在OP治療中有著確切的療效，目前，中藥單體的相關研究也引起越來越多國內外專家的重視，相關研究也證實中藥在OP治療中具有不可替代的作用。

動物實驗發現，PI3K/ AKT通路介導下，不同濃度丹參素和白藜蘆醇均可以升高骨密度值，降低OP大鼠相關細胞凋亡率，抑制如 cyto- C、Bax、AIF等相關蛋白的表達[17]。在對丹參單體進一步實驗發現，其有效成分中丹酚酸B，能明顯上調PI3K及p-AKT表達，激活PI3K/AKT通路進而刺激MC3 T3-E1細胞骨形成[18]。也有研究指出，丹酚酸A也能降低TNF-α、IL-6水平，使AKT磷酸化水平上調，降低Bax蛋白的表達[19]。同時，中藥丹參有效成分中的紫草酸鎂B(MLB)可以通過誘導AKT磷酸化，顯著提高內皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化水平從而恢復微循環障礙，恢復受損大鼠后肢血流[20]。

中藥黃芪的研究中發現，其提取物毛蕊異黃酮(Calycosin)在成骨作用部分涉及 IGF1 R/ PI3K/ AKT通路，在10-8～10-6mol/L范圍內對細胞增殖、堿性磷酸酶活性和茜素紅S染色均有劑量依賴性的增強作用，而在10-5mol/L范圍內有抑制作用；在最佳濃度時，可以增加成骨基因的mRNA水平和IGF1R和AKT的磷酸化；此外，GSK或LY治療后可部分逆轉毛蕊異黃酮對ROBs的影響，表現為毛蕊異黃酮誘導的ALP活性降低、鈣化結節和成骨基因表達減少[21]。

淫羊藿的主要活性成分之一淫羊藿苷(Icariin)能夠對GCs誘導的SaoS-2細胞和小鼠OP變化有保護作用；實驗中發現，DEC1(一種結構獨特的螺旋環螺旋蛋白)的過度表達和敲除分別反向調節Wnt/β- catenin和 PI3K/ AKT信號通路中的關鍵分子β- catenin和 PIK3 CA的表達，Wnt/β- catenin信號抑制物 DKK1和 PI3K/ AKT信號抑制物 LY294002抑制了淫羊藿苷對 DEC1的誘導作用，研究指出，DEC1在 PI3K/AKT/GSK3β/β- catenin綜合信號通路支持淫羊藿苷抗GCs型OP的作用[22]。

有實驗研究發現，從川續斷根分離的一種由半乳糖和甘露糖組成，分子量為2.61×104Da的均一多糖(DAP)，能夠通過上調VEGF和骨保護素(osteoprotegerin，OPG)，下調RANK和RANKL蛋白和mRNA的表達，激活PI3K/Akt/eNOS通路以達到預防和治療絕經后OP[23]。

實驗發現，馬齒莧能有效抑制PI3K、Akt、雷帕霉素哺乳動物靶點(mTOR)、NF-κB的磷酸化及NF-κBα(IκBα)表達，并通過PI3K/Akt/mTOR和Nrf2/HO-1/NF-κB途徑達到抗炎和抗氧化作用[24]。同時，馬齒莧中分離得到(E)-5-羥基-7-甲氧基-3-(2′-羥基芐基)-4-色曼酮分析發現，(E)-5-羥基-7-甲氧基-3-(2′-羥基芐基) -4-色曼酮可以激活并促進3T3-L1脂肪細胞的PI3K/Akt及AMPK途徑刺激葡萄糖轉運蛋白GLUT4向質膜轉運，提高葡萄糖攝取，預防脂多糖誘導的骨量丟失[25]。

人參及其組方在OP治療由來已久，研究發現，人參酚酸提取物(PG2)能影響PI3K/Akt/eNOS通路的磷酸化，增加細胞活力，抑制棕櫚酸酯誘導的細胞內脂質積聚及內皮素1(ET-1)過度表達，從而發揮保護內皮功能的作用[26]。

另有研究指出，燈盞花素、銀杏內酯B、北五味子乙素等均能在PI3K/AKT通路介導下，影響相關細胞凋亡。

2.2 中藥復方

中醫藥治療OP由來已久，盡管中藥成方針對不同患者組方選藥并不完全相同，但就總體效果而言，中醫藥治療OP有著顯著的效果。

實驗證明，中藥成方補腎活血方含藥血清能夠在PI3K/AKT通路介導下影響OB增殖，同時激活p38 MAPK和 PI3K/AKT通路介導OB分化，研究認為，p38 MAPK及 PI3K/ AKT是補腎活血方在OP治療中的主要作用機制[27]。有學者在對經典方劑鹿角膠丸研究中指出，鹿角膠丸有效成分可以通過 PI3K/AKT通路，增加 OC凋亡，并在此過程中促進Bcl-2的表達，抑制Bax的表達，抑制Caspase 3的裂解[28]。動物研究發現，四物湯能夠直接或間接影響GPER通路，調節在GPER相關下游信號分子PI3K、p- AKT表達，促進OB增殖[29]。對成方恒古骨傷愈合劑的研究中也有發現，其有效成分可通過調控PI3K/ AKT通路促進OB增殖治療絕經后OP[30]。其他中藥成方如當歸補血湯、和血生絡方及益氣化瘀湯等，均能夠通過PI3K /AKT通路介導，影響相關細胞增殖和凋亡。

2.3 針灸

針灸作為傳承已久的中醫治療手段之一，近年來越來越多地被應用于OP治療及輔助治療之中。大量動物研究證實，針刺對OP模型小鼠存有一定療效。在對相關機制探究中，PI3K/AKT被證明是針刺治療OP的一個重要途徑。

動物實驗表明，對卵巢早衰大鼠針刺后，大鼠體內PI3K/ AKT/ mTOR通路mRNA及蛋白表達量升高，血清雌二醇(estradiol，E2)分泌恢復至正常，卵巢功能基本恢復，在治療效果上，與雌激素治療效果相當[31]。這也為絕經后OP患者的治療研究提供了新的方向。在MCAO模型小鼠針刺研究中，免疫組化及Western blotting顯示：針刺“曲池”“足三里”穴位后，PI3K、AKT磷酸化水平均有所提升，同時，Bax表達抑制明顯[32]。還有研究指出，深刺“環跳”穴可以影響PI3K/AKT通路，抑制大鼠坐骨神經損傷后的神經細胞凋亡，促進神經損傷修復[33]。動物研究指出，電針刺激大鼠內、外膝眼可激活PI3K/AKT，影響 Bcl-2、Bax等相關蛋白表達，并減少相關炎癥因子IL-1β、TNF-α生成，抑制相關細胞的凋亡[34]。也有國內學者[35]研究指出，電針刺激可 PI3K/AKT介導骨髓內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，促進相關區域血管再生。

穴位埋線治療作為近些年發展起來，針灸治療的一個延伸。相關研究發現，穴位埋線能夠直接或間接影響PI3K/AKT通路，上調相關蛋白，如GLUT4蛋白表達，調整相關激素水平。

3 小結及展望

PI3K/AKT通路是OP發病機制中一種重要細胞信息傳導途徑，該通路能夠通過對OB、OC及 VEGF、NO及缺氧誘導因子等多種與血管再生方面的相關因子等信號加以調控，在OP的治療中發揮重要作用。但有部分研究提出，該通路激酶3β的水平下對可調控因子發揮雙向調節作用，由于目前缺乏對激酶3β定量分析和研究來確定準確的界限的相關研究，單純通過PI3K/AKT通路治療OP仍存在著較大限制。

動物實驗及其他實驗發現，中藥單體及中藥成方的有效成分，針刺等中醫藥治療手段均能夠通過直接或間接激活 PI3K/AKT通路，調控下游相關信號分子，影響OB、OC等相關細胞分化及增殖。但由于中藥中有效成分較多，分離作用成分及確定中藥成方中發揮作用的主要有效成分仍是亟待解決的主要問題。

目前研究證實，多種中醫治療手段如針灸、方劑等在治療OP中均有著確切、顯著的效果，而PI3K/AKT是這些干預手段中主要作用機制之一，這也為OP治療相關機制研究提供了思路。以PI3K/AKT通路這一支點，更多OP治療手段將會被發掘，PI3K/AKT通路也能夠為更多新藥研發提供更多思路及重要靶點。更多的中醫藥治療方法的作用機制的發現，也會更加的有利于中醫的推廣和普及。