基于網絡藥理學分析“人參-鹿茸”藥對治療阿爾茨海默癥的作用機制

張楠茜，李春楠，呂經緯，高曉晨，張齡予，張 輝，孫佳明

（長春中醫藥大學，長春 130117）

阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）作為一種中樞神經系統退行性疾病，其患者通常出現記憶功能減退、語言障礙、時間定向力障礙等癥狀，目前已嚴重威脅到老年人的健康及生活[1]。中醫理論認為，氣血虧虛、營衛不和、五臟失衡可致神明受損、腦髓空虛、神失所養，進而導致老年癡呆。人參味甘而微苦，微溫不燥，功善大補元氣，養血生津，廣益五臟，為“治虛勞內傷之第一要藥”[2]；鹿茸味甘咸性溫，《本草綱目》載曰：“生精補髓，養血益陽，強健筋骨”。二者一擅補益元氣，一能補腎益精，合用則陽得陰助，陰得陽化，養陰補髓、填精充腦。據文獻報道較多改善記憶功能的方劑均含有人參、鹿茸，故將“人參-鹿茸”配伍，可精簡組分，提高其藥效。

中藥網絡藥理學是建立在高通量組學數據分析、計算機虛擬計算及網絡數據庫檢索等技術基礎上的一種新方法，因其具有整體性和系統性的優勢，現已廣泛應用于中藥復方及單味藥的作用機制研究中[3-4]。介于“人參-鹿茸”化學成分復雜且用于治療阿爾茨海默癥的作用機制尚不明確，本文利用網絡藥理學“多成分-多靶點-多途徑”的特點通過網絡分析方法篩選出人參和鹿茸中的潛在活性成分及相關靶點，并構建藥物分子靶點-疾病之間的協同作用關系，最后系統解析藥對間的相互作用關系，為深入研究“人參-鹿茸”藥對治療阿爾茨海默癥提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 建立人參-鹿茸化學成分數據庫 利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http：//sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php）及中藥分子機制生物信息學分析平臺（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）挖掘人參、鹿茸相應化學成分。同時，還從TCMSP 數據庫獲得了7 種重要的藥理學相關性數據，包括分子量（MW），脂水分配系數（AlogP），氫鍵供體數（Hdon），氫鍵受體數（Hacc），生物利用度（OB），藥物細胞穿透性（Caco-2），類藥性（DL）。

1.2 有效成分篩選 以利賓斯基五法則（ADME）為理論依據，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性指數（drug-like lndex，DL）≥0.18 為指標對人參、鹿茸中的有效成分進行篩選。同時滿足OB ≥30%，DL ≥0.18 這2 個標準的有效成分可進行下一步分析。同時，利用Google Scholar 進行大規模的文本挖掘，將含量高或活性強的化合物也歸入有效成分庫中。

1.3 靶點預測 首先，將有效成分導入Swiss Target Prediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch），通過2D 和3D 結構相似性預測有效成分的靶點。在 TTD 數據庫中輸入“Alzheimer”關鍵詞搜索與阿爾茨海默癥相關的靶點，所得靶點即為阿爾茨海默癥靶點。將有效成分與阿爾茨海默癥相關的靶點進行映射，可得 “人參與鹿茸”與阿爾茨海默癥進行相互作用的核心靶點，同時使用蛋白質數據庫（uniprot database）選擇物種為“homo sapiens（human）”的靶點,將靶點名稱和基因名稱進行轉換。

1.4 GO 生物過程注釋富集及KEGG 信號通路分析利用 Cytoscape 軟件中的“ClueGO”插件對的核心靶點進行 GO（gene ontology）生物過程注釋富集，建立 GO 生物過程注釋層級關系圖，分析核心靶點在體內強有效性的生物過程注釋。KEGG 信號通路分析利用Metascape數據庫（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）將核心靶點進行KEGG（kyoto encyclopedia of genesand genomes）信號通路富集，物種與背景設置均為“homo sapiens”（智人），研究關鍵靶點投射的 KEGG 信號通路與疾病之間的相互關系，明確可能的藥理機制。

1.5 網絡構建 構建兩個網絡：1）成分-靶點網絡（CT 網絡），將 “人參-鹿茸”有效成分與其相應的靶點構建CT 網絡；2）成分-靶點-通路網絡（CTP網絡），建立由成分、靶點及其相應通路組成的CTP網絡。所有可視化網絡圖由Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）構建，利用 Network Analyzer 插件計算 Degree 值，對核心靶點與信號通路間的作用關系進行進一步分析。

1.6 貢獻指數計算 為了預測 “人參-鹿茸”中每種有效成分治療阿爾茨海默癥的貢獻值，提出了基于成分網絡效能（NE）的文獻加權貢獻指數（CI）計算。

2 結果

2.1 潛在活性成分篩選結果 由于單味藥材及中藥復方中的成分繁多且復雜，為了得到具有良好藥效學和藥代動力學特性的有效成分，本研究選擇ADME（吸收，分布，代謝和排泄）參數作為篩選指標。利用TCMSP和TCM 在“人參-鹿茸”中共篩選得到230 個化合物，其中人參190 個，鹿茸40 個。以OB ≥30%和DL ≥0.18 為指標進行進一步篩選，最后在“人參-鹿茸”藥對中得到29 個具有良好ADME 性質的潛在活性成分。其中人參中包括Stigmasterol、β-Sitosterol、Kaempferol 和Ginsenoside Rh2 等16 個潛在活性成分；鹿茸中包括17-Beta-Estradiol、Glicosamine 和Adenosine Triphosphate 等13 個潛在活性成分。結合文獻報道可知，Kaempferol 具有抗炎、抗腫瘤作用[5-6]；FrutinoneA表現出有效的抗細菌和真菌的特性[7]；Adenosine Triphosphate 具有調節突觸傳遞和膠質細胞的作用[8]；Ceramide 可調節細胞分化、增殖、凋亡和衰老等生命活動[9]。

2.2 “人參-鹿茸”治療阿爾茨海默癥靶點預測 目前可用來篩選新藥與阿爾茨海默癥相關靶點的實驗方法有限且耗時較長，故本實驗利用計算機模擬的思路來篩選“人參-鹿茸”有效成分和阿爾茨海默癥的目標靶點。通過Swiss Target Prediction 數據庫和TTD 數據庫篩選，映射出40 個“人參-鹿茸”有效成分與阿爾茨海默癥相關的靶點，其中排名前5 的目標靶點分別 為muscarinic acetylcholine receptor M2（CHRM2）、acetylcholinesterase（ACHE）、butyrylcholinesterase（BCHE）、peroxisome proliferator-activated receptor gamma（PPARG）、dopamine D2 recepto r（DRD2）。

2.3 抗阿爾茨海默癥的生物過程注釋及通路分析 為了進一步闡明“人參-鹿茸”與阿爾茨海默癥相關靶點的作用機制，利用Cytoscape 軟件中的“Clue GO”插件和Metascape 數據庫對“人參-鹿茸”治療阿爾茨海默癥的40 個核心靶點進行GO 生物過程注釋富集及KEGG 信號通路分析。以P＜0.01 為標準對26 個核心靶點進行GO 生物過程注釋富集分析，得到12 個GO 生物過程注釋，包括分子功能層面的淀粉樣β 蛋白的反應和G 蛋白偶聯受體活性，以及細胞組分中的突觸傳遞的負調節和調節突觸后膜電位等系列生物過程注釋。

在KEGG 通路富集分析中共得到 32 條信號通路，根 據P＜0.01 篩選出排名靠前的9 條信號通路，分別為神經活性配體-受體相互作用（hsa04080）、癌癥的途徑（hsa05200）、5-羥色胺能突觸（hsa04726）、cAMP信號通路（hsa04024）、PI3K-Akt信號通路（hsa04151）、磷脂酶D 信號通路（hsa04072）、味覺轉導（hsa04742）、補體和凝血級聯（hsa04610）和阿爾茨海默癥（hsa05010）。

潘玲珍等[10]研究了長期使用地西泮對小鼠神經活性配體受體相互作用信號通路的影響。通過長期且逐量遞增的方式給小鼠連續灌胃地西泮60 d，提取小鼠全腦總mRNA，進行小鼠全基因組芯片檢測，運用生物信息學方法篩選出差異表達基因，并通過《京都基因與基因組百科全書》的基因功能通路數據庫分析神經活性配體受體相互作用信號通路的變化。結果發現，與正常組比較，地西泮組的神經活性配體受體相互作用信號通路上的16 個基因表達發生了顯著性變化，其中表達上調的基因有9 個，表達下調的基因有7 個。其實驗結果表明，神經活性配體-受體相互作用信號通路是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體配體的集合。

張泓波等[11]通過觀察補陽還五湯對血管性癡呆大鼠海馬組織環磷酸腺苷（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）-cREB 反應元件結合蛋白（CREB）信號通路的影響，發現cAMP 信號通路可增強多種靶點基因的表達并增加突觸數量，進而提高記憶能力。其將大鼠隨機分為補陽還五湯組、尼莫地平組、模型組、假手術組。用改良Pulsinelli’s 四血管阻斷法建立血管性癡呆大鼠模型,分別給予相應的藥物，連續治療30 d。利用放射免疫分析法檢測海馬組織cAMP 含量，Western blotting 法檢測PKA 催化亞基（PKAc）蛋白表達，電泳遷移率改變分析法檢測CREB 的DNA 結合活性。結果表明，與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織cAMP 含量、PKAc 蛋白表達和CREB 的DNA 結合活性均降低（P＜0.01）；與模型組比較，補陽還五湯組和尼莫地平組cAMP 含量、PKAc 蛋白表達和CREB的DNA 結合活性均升高（P＜0.01）。補陽還五湯可增加血管性癡呆大鼠海馬cAMP 含量、PKAc 蛋白表達和CREB 的DNA 結合活性，增強cAMP-PKA-CREB信號通路的作用進而起到改善大鼠血管性癡呆的情況。

GABBOUJ S 等[12]研究發現，胰島素-PI3K-Akt 信號通路在大腦的多種生理功能中起著重要的作用，如代謝、突觸形成和細胞生長和存活。基于流行病學、臨床和動物模型的研究結果已經建立了T2D 和AD 之間的密切聯系，PI3K-Akt 信號的改變是這些疾病的共同點。當磷脂酰肌醇水平降低時，在AD 患者的腦中觀察到5-二磷酸3-激酶（PI3K）亞基以及鈍的Akt 激酶磷酸化，其特征與β-淀粉樣和tau 蛋白現象相似。通過鼻內胰島素（IN）治療增強了CNS 中PI3K-Akt信號傳導，可改善記憶。已知胰島素通過PI3K-Akt 信號通路增強神經元生長和突觸形成。但是，PI3K-Akt途徑在其他細胞類型（如小膠質細胞和星形膠質細胞）中也介導與不同功能相關的信號傳導。此外，最近發現有缺陷的Trem2 產生Aβ 噬菌斑的轉基因時，小鼠小膠質細胞中的信號傳導同時也會導致Akt-mTORC1信號傳導受損及AMP 活化蛋白激酶的活化。這導致了自噬體的積累，代謝障礙。此外，小膠質細胞形成周圍簇的能力下降Aβ 斑塊和營養不良性神經突的形成增加。因此，TREM2-DAP12 信號利用與胰島素部分相同細胞，通過PI3K-Akt 信號通路誘導其下游效應。由此可見，PI3K-Akt 信號通路可在細胞增殖和分化等方面起到重要作用。

2.4 網絡圖構建及貢獻指數分析 通過Cytoscape 3.7.1 構建“成分-靶點”網絡圖和“成分-靶點-通路”網絡圖。“成分-靶點”網絡圖中包含69個節點（nodes）和214 條邊（edges），其中2 個靶點為人參單獨作用于阿爾茨海默癥，5 個靶點為鹿茸單獨作用于阿爾茨海默癥，剩余33 個靶點為人參、鹿茸共同作用于阿爾茨海默癥，這說明 “人參-鹿茸”配伍可起到協同作用于阿爾茨海默癥的效果。“成分-靶點-通路”網絡圖中包括78 個節點（Nodes）和284 條邊（Nodes），其中有9 個節點為KEGG 通路富集中得到排名靠前的9 條重要通路，人參和鹿茸通過40 個靶點協同作用于重要通路中。

網絡中的高度互聯源于各節點的高值，結合文獻加權的網絡功效提出了每個有效成分的貢獻指數，根據計算結果所示，“人參-鹿茸”中17-Beta-Estradio（LR-1）、Adenosine Triphosphate（LR-3）、Retinol（LR-8）、Kaempferol（RS-3）、Ginsenoside Rb1（RS-16）和Panaxadiol（RS-12）6 個有效成分對治療阿爾茨海默癥的貢獻最大，置信區間（confidence interval，CI）值為87.13%。因此，以上6 個有效成分為 “人參-鹿茸”藥對治療阿爾茨海默癥的主要物質基礎。

3 討論

人參和鹿茸皆為名貴中藥，被歷代醫家所選用，基于二者“扶正固本，生精益血”的特性，常被組成具有調神養身、益智抗衰功效的方劑。目前人口老齡化問題較為嚴峻，阿爾茨海默癥作為一種嚴重影響中老年人工作和生活的疾病，已引起生物醫學界的廣泛關注。由于阿爾茨海默癥的致病機制較為復雜，目前對其發病機制尚未明確，故本文從網絡藥理學“多成分-多靶點-多通路”的角度闡明“人參-鹿茸”在治療阿爾茨海默癥上的分子協同作用。將利用ADME法則篩選出的29個有效成分進行文獻加權，結果發現，已有較多文獻報道[13-17]人參和鹿茸中的有效成分治療阿爾茨海默癥的生物活性，表明ADME 篩選標準的可信度。通過CTP 網絡圖可發現，“人參-鹿茸”中的有效成分與阿爾茨海默癥相關的核心靶點之間具有密切聯系，其中Cholesterol、17-Beta-Estradiol、β-sitosterol和 Kaempferol 等有效成分可通過AChE 靶點作用于cAMP信號通路；Ginsenoside Rb1、Girinimbin、Frutinone A 和Vitamin B1 等有效成分可通過PTRS2 靶點作用到PI3K-Akt 信號通路上，PI3K -AKT 信號通路作為細胞生存信號通路之一，對細胞增殖、分化、抑制神經細胞凋亡均有重要意義。從網絡藥理學結果可知，“人參-鹿茸”中的三萜類化合物、黃酮類化合物和甾類化合物等藥效成分可通過減輕炎癥反應、降低乙酰膽堿酯酶活性、通過PI3K-Akt 信號通路抑制 tau 蛋白過度磷酸化，穩定鈣離子濃度減少神經元凋亡而發揮治療阿爾茨海默癥的作用，其中AChE 靶點和PI3K-Akt 信號通路在阿爾茨海默癥復雜的病理機制網絡中起到重要作用，與目前文獻[18-19]報道的情況基本相符。

本研究基于網絡藥理學方法篩選出“人參-鹿茸”藥對中治療阿爾茨海默癥的活性成分及相關作用靶點，并進一步建立成分-靶點網絡圖，分析生物過程注釋及信號通路，從系統上研究“人參-鹿茸”藥對治療阿爾茨海默癥的內在規律，確定了人參、鹿茸在機體分子層面的核心靶點，闡釋了其治療阿爾茨海默癥潛在的物質基礎和作用機制，同時也為中藥研究阿爾茨海默癥復雜的應用提供了參考。