頭針聯(lián)合中藥對缺血性腦卒中后認(rèn)知障礙大鼠P38MAPK作用研究

張 野，叢德毓，張紅石，胡冠宇，汲廣成，王宇峰*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.吉林省中醫(yī)院，長春 130021；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院，長春 130117）

缺血性腦卒中是引起認(rèn)知障礙的主要因素，絕大多數(shù)缺血性腦卒中患者都會(huì)伴有認(rèn)知障礙，嚴(yán)重者會(huì)有抑郁傾向。目前認(rèn)為認(rèn)知障礙病變的關(guān)鍵部位在尾狀核、丘腦、內(nèi)囊膝部、角回和額頂葉等，且在左半球損傷的認(rèn)知障礙較右側(cè)重。流行病學(xué)和臨床病理研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知障礙與腦血管病變密切相關(guān)。大鼠P38絲裂源活化蛋白激酶（P38MAPK）磷酸化后可被激活，參與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，是機(jī)體眾多細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中轉(zhuǎn)站，是各類炎癥反應(yīng)的重要激酶，一般認(rèn)為激活升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，但是對腦損傷需要進(jìn)一步研究。研究[1]表明P38MAPK 在阿爾茨海默病血液與疾病持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)，也就是認(rèn)知障礙患者中P28MAPK 表達(dá)增加，且在大腦與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)區(qū)域中高度表達(dá)[2]。在各種認(rèn)知障礙動(dòng)物模型中也進(jìn)證實(shí)了p38MAPK 參與 Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的證據(jù)表明，p38MAPK 活性在認(rèn)知障礙的病理展中起重要作用，抑制認(rèn)知神經(jīng)元細(xì)胞中 p38MAPK 的激活是認(rèn)知障礙的治療途徑之一。

1 材料與方法

1.1 材料 從長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購買SD 大鼠30 只，體質(zhì)量（220～230）g，進(jìn)入長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，隨機(jī)分為3 組，每組10只，其中2 組進(jìn)行腦卒中造模，隨機(jī)選擇1 組作為頭針聯(lián)合中藥組進(jìn)行頭針和中藥治療，另1 組作為模型組不予治療，未造模1 組作為空白組作為健康對照，飼養(yǎng)間保持溫度光照和濕度為23℃、12/12 光照周期（55±10）%，并自由飲水。實(shí)驗(yàn)過程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求，已經(jīng)通過長春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批（20190151）。

1.2 缺血性腦卒中大鼠模型建立 采用改良的大腦中動(dòng)脈栓塞在灌注（MCAO）造模法，術(shù)前24 h大鼠禁食不禁水，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35 g/kg），確保大鼠手術(shù)全程無痛，以仰臥固定后常規(guī)消毒。在頸部正中切一口，用止血鉗鈍性分離組織，找到左側(cè)頸總動(dòng)脈，分離左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，掛線備用，結(jié)扎頸外動(dòng)脈。再結(jié)扎頸總動(dòng)脈，夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸總動(dòng)脈上距離分叉2 mm 處剪一斜口，穿入線栓，輕提頸內(nèi)動(dòng)脈縫合線并松開頸內(nèi)動(dòng)脈血管夾，沿頸內(nèi)動(dòng)脈將線栓穿過顱骨直至手下有明顯阻力時(shí)（18 mm），實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈阻塞，導(dǎo)致腦缺血。結(jié)扎切口并固定線栓，剪斷多余部分縫合線，縫合傷口，予大鼠注射青霉素20 萬單位，防止感染，完成造模。造模后進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

1.3 干預(yù)方法 頭針聯(lián)合中藥治療，在造模成功后，首先中藥灌胃，按照成人1/30 的比例用量，以赤芍20 g，川芎20 g，蒲黃20 g，葛根20 g，槐花20 g，地龍20 g，紅花12 g，豨薟草30 g，三七18 g，加適量水熬2 h，剩余藥液300 mL。給藥時(shí)每只大鼠灌胃5 mL。頭針治療在灌胃后進(jìn)行，取腦部的頂區(qū)及頂前區(qū)，以0.5 寸針向前方刺入，采取叢刺法和長留針方式，以醫(yī)用膠布塊固定，放入無墊料籠中，配合帶針運(yùn)動(dòng)，留針6～8 h，每日1 次，每周針刺5 次，持續(xù)4 周。

1.4 血清和腦組織中p38MAPK 濃度測定 治療周期結(jié)束后，分別將空白組、模型組、聯(lián)合組的大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35 g/kg），確保大鼠肌肉放松并且無痛，剪開腹腔，腹主動(dòng)脈取血5 mL，并將血液樣本離心（2 000×g，4℃、15 min），離心后獲得上層血清。大鼠處于麻醉狀態(tài)，取血后斷頭處死，立即剝離腦組織，腦樣本按質(zhì)量體積比1 g:9 mL 加入9 倍體積的磷酸鹽緩沖液（PH 7.4），手工或勻漿器將標(biāo)本充分勻漿并離心（2 000×g，4℃、15 min），收集上清液體備用。采用ELISA 法檢測大鼠血清p38MAPK（南京建成生物工程研究所；大鼠96T），嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 大鼠行為學(xué)檢測 Morris 水迷宮試驗(yàn)，用于測試大鼠的復(fù)雜記憶和空間定位能力。水迷宮（ZS-001moriss）由一個(gè)圓柱形水槽和圖像采集分析系統(tǒng)構(gòu)成（DIGITAL CCD CAMERA），四周圍有遮光布，減少外界干擾，利用動(dòng)物求生本能，尋找隱藏水中的平臺(tái)，記錄每只大鼠所需要的時(shí)間和路線。

1.6 觀察指標(biāo) 觀察各組大鼠血清及腦組織中p38MAPK 的濃度和大鼠行為學(xué)檢測的水迷宮測試、懸吊試驗(yàn)，并且結(jié)合大鼠行為學(xué)改變與大鼠血清和腦組織內(nèi)p38MAPK 的濃度變化分析頭針聯(lián)合中藥的作用機(jī)制。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，治療前后對比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 建模結(jié)果 建模后未出現(xiàn)大鼠腹膜炎跡象，具有正常生命體征，觀察10 只空白對照大鼠和20 只造模大鼠（模型組和聯(lián)合組）在造模前后的行為學(xué)變化，水迷宮測試結(jié)果顯示造模前3 組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，造模后2 組與空白組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示造模成功，見表1。

表1 各組造模前后水迷宮測試時(shí)間比較（，n =10）s

表1 各組造模前后水迷宮測試時(shí)間比較（，n =10）s

注：與空白組比較，# P ＜0.05

2.2 P38MAPK 濃度結(jié)果 大鼠血清中P38MAPK 濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；聯(lián)合組與模型組比較，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。大鼠腦組織中P38MAPK濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合組與模型組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表2。

表2 各組血清與腦組織內(nèi)P38MAPK 比較（，n =10）（nmol/L）

表2 各組血清與腦組織內(nèi)P38MAPK 比較（，n =10）（nmol/L）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.3 治療1 周后大鼠行為學(xué)功能結(jié)果 觀察3 組大鼠在治療前后的行為學(xué)變化。水迷宮測試結(jié)果顯示，聯(lián)合組在治療前后比較，尋找平臺(tái)時(shí)間減少，具有顯著性差異（P＜0.01），治療后模型組分別和空白組、聯(lián)合組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表3。治療后模型組、空白組、聯(lián)合組大鼠行為學(xué)路線比較，見圖1。

表3 各組治療前后水迷宮測試時(shí)間比較（，n =10） s

表3 各組治療前后水迷宮測試時(shí)間比較（，n =10） s

注：與其他2 組比較，# P ＜0.05

圖1 大鼠治療前后水迷宮測試路線比較

3 討論

缺血性腦卒后的認(rèn)知障礙屬于中醫(yī)理論中的“呆病”范疇，是腦動(dòng)脈梗死引起的腦組織缺血和缺氧而導(dǎo)致。針刺和中藥臨床聯(lián)用療效顯著，研究[3]表明針灸和中藥可以抗血栓、保護(hù)血管，能夠?qū)τ谘軆?nèi)皮組織細(xì)胞產(chǎn)生影響，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮再生和重塑，增加側(cè)支循環(huán)，結(jié)合長白山通經(jīng)調(diào)臟手法流派學(xué)術(shù)實(shí)踐，采用頭針聯(lián)合中藥的治療方案進(jìn)行治療，一方面通過對督脈的疏通，調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)功能，尤其注重觀察神智方面癥狀的改善；另一方面活血化瘀的藥物，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管再生，達(dá)到“治神調(diào)形”的效果，臨床應(yīng)用較廣，療效確切，但是多停留于理論方面和臨床觀察研究，在作用機(jī)理方面仍然缺乏足夠認(rèn)識。

頭針聯(lián)合中藥治療方案是基于活血通經(jīng)的傳統(tǒng)治療原則和腦缺血后的血管再生保護(hù)機(jī)制而確立。血管再生（angiogenesis）是通過血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化增殖、轉(zhuǎn)運(yùn)、重組、分裂、分支而形成新的血管網(wǎng)絡(luò)，從而改善局部血液循環(huán)和血氧供應(yīng)，與中醫(yī)的活血通經(jīng)理論具有一致性，在既往的臨床治療中顯示具有良好療效，但是缺少理論機(jī)制的研究。腦卒中是由于大腦動(dòng)脈突然閉塞而導(dǎo)致的腦血流減少，腦組織由于循環(huán)不足、缺少氧氣以及能量不足而導(dǎo)致神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等功能損害，致使認(rèn)知障礙等一系列病變。所以基于《靈樞經(jīng)》“頭有氣街”理論，并結(jié)合缺血性腦卒中與頭氣街的聯(lián)系，應(yīng)用頭針方法進(jìn)行治療。治療腦卒中主要選取頂區(qū)和頂前區(qū)以及額區(qū)，并以頭部的重要經(jīng)脈督脈作為縱向維度基準(zhǔn)，既符合頭針分區(qū)理論又兼顧通督調(diào)神理念。本研究選取活血化瘀的赤芍、紅花、地龍、蒲黃、三七和通經(jīng)絡(luò)的川芎、葛根、槐花、豨薟草進(jìn)行組方，依據(jù)臨床實(shí)踐中對于卒中后認(rèn)知障礙治療，進(jìn)行對腦卒中后認(rèn)知障礙大鼠模型治療的實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合p38MAPK 探索其作用機(jī)制。

P38MAPK是能夠感受不同的生物學(xué)刺激的物質(zhì)之一，參與許多信號傳到通路，在中樞系統(tǒng)中P38MAPK與學(xué)習(xí)和記憶功能相關(guān)[4]，在學(xué)習(xí)記憶區(qū)域高度表達(dá)，可能是相關(guān)腦功能的關(guān)鍵信號[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模后模型組的血清內(nèi)檢測P38MAPK 濃度高于空白組（P＜0.01）。造模后模型組的腦組織內(nèi)P38MAPK濃度高于空白組（P＜0.05），說明腦卒中后認(rèn)知障礙大鼠模型的血液及腦組織中P38MAPK 濃度均受到影響，這與研究[6]關(guān)于P38MAPK 參與Aβ 誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的研究一致。楊申[7]予血管性癡呆大鼠模型P38MAPK 抑制劑SB202190，結(jié)果證明P38MAPK 是導(dǎo)致認(rèn)知障礙發(fā)生的物質(zhì)之一，且相關(guān)通路具有促進(jìn)神經(jīng)元生長作用。研究[8]發(fā)現(xiàn)P38MAPK 可以激活下游Caspase-3，能夠啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷，治療后聯(lián)合組血清內(nèi)P38MAPK 濃度低于模型組（P＜0.01），聯(lián)合組腦組織內(nèi)P38MAPK 濃度低于模型組（P＜0.05），說明頭針聯(lián)合中藥的方案能夠通過干預(yù)P38MAPK 修復(fù)卒中后大鼠認(rèn)知障礙功能。P38MAPK 可以激活下游Caspase-3，能夠啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷。治療后聯(lián)合組血清內(nèi)P38MAPK濃度低于模型組，有顯著性差異（P＜0.01），聯(lián)合組腦組織內(nèi)P38MAPK 濃度低于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說明頭針聯(lián)合中藥的方案能夠通過干預(yù)P38MAPK 從而修復(fù)卒中后大鼠認(rèn)知障礙功能。

綜上所述，本研究表明大鼠腦組織和血清內(nèi)P38MAPK 濃度升高與大鼠缺血性腦卒中的認(rèn)知障礙發(fā)生相關(guān)，大鼠血清和腦組織內(nèi)P38MAPK 參與卒中大鼠認(rèn)知恢復(fù)過程，頭針聯(lián)合中藥的治療方案可以促進(jìn)卒中后認(rèn)知障礙大鼠模型血清及腦組織內(nèi)P38MAPK的濃度降低，能夠促進(jìn)修復(fù)受損傷大鼠模型的空間記憶能力。