升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠骨骼肌線粒體動力學的影響研究

李玲玲，蘇 磊，胡夢圓，張昕雨，魯 藝

（北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029）

慢性疲勞綜合征是一種涉及全身臟器，影響人們生活質量的復雜疾病，本病發生多與慢性應激相關[1-2]。近年來，慢性疲勞綜合征的發病率越來越高[3]，但其發病機制尚不明確，目前認為主要涉及能量代謝紊亂、炎癥反應、遺傳因素等，線粒體動力學對細胞能量代謝具有重要的意義[4-5]。西醫對此尚無令人滿意的治療方法，中醫治療此病的優勢日益顯現。中醫學將慢性疲勞綜合征歸屬于“虛勞”“郁證”范疇[6]。臨床研究[7]結果表明，升陽散火湯可以顯著改善CFS患者的癥狀和抑郁狀態，但升陽散火湯治療慢性疲勞綜合征的機制尚不明確。其具體機制和拆方后的各個組合的抗疲勞作用尚值得進一步探討。本研究采用冰水游泳、慢性束縛、夾尾復合方法構建慢性疲勞小鼠模型，從線粒體動力學的角度，探討升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠行為學及骨骼肌線粒體超微結構的影響，以期明確慢性疲勞小鼠的線粒體損傷情況及升陽散火湯及其拆方的干預效果。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性ICR 小鼠50 只，體質量（20±2）g，SPF 級，5～6 周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證編號：SCXK（京）2016-0006。完全按照動物中心飼養標準飼養，SPF 級環境，溫度18～25℃，自由攝食和飲水，定期觀察小鼠生長狀況，及時更換墊料并定時給藥。實驗經過北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會審查。動物倫理號：BUCM -4 -2021030301-1017

1.2 藥物制備 升陽散火湯所含藥味生甘草（批號20022551）每袋24 g，相當于飲片120 g；防風（批號20008401）每袋12 g，相當于飲片120 g；升麻（批號20007371）每袋16 g，相當于飲片160 g；葛根（批號19029601）每袋16 g，相當于飲片160 g；獨活（批號20009871）每袋32 g，相當于飲片160 g；白芍藥（批號20020801）每袋8 g，相當于飲片160 g；羌活（批號20005711）每袋16，g 相當于飲片160 g；人參（批號20008481）每袋32 g，相當于飲片160 g；柴胡（批號20022891）每袋20 g，相當于飲片200 g；炙甘草（批號20018851）每袋24 g，相當于飲片120 g。取相當于飲片等量的各味藥顆粒劑，混合后，用100 ℃蒸餾水配制成升陽散火湯水溶液備用。配方顆粒均由北京康仁堂藥業有限公司提供，經北京中醫藥大學東方醫院制劑室進行質量控制檢測。

1.3 試劑及儀器

1.3.1 試劑BCA蛋白定量試劑盒（貨號：PC0020）、RIPA裂解液（貨號：R0020）、預染蛋白marker（貨號：PR1920）、PVDF膜（貨號：IPVH00010）、Super ECL Plus 升級版超敏發光液（貨號：P1010），均購于北京拜爾迪生物科技有限公司；GAPDH（貨號TA-08）、DRP1 Rabbit Antibody（貨號：YT1414）、MFN1 Rabbit Antibody（貨號YN3054）、OPA1 Rabbit Antibody（貨號：YN2976）均購于Proteintech 公司；TEMED（貨號：T8133）、辣根酶標記山羊抗兔IgG（貨號：ZB-2301）、辣根酶標記山羊抗鼠IgG（貨號：134560）均購于北京百諾威生物科技有限公司。

1.3.2 儀器 MIKRO 22R 低溫冷凍離心機（德國Hettich 公司），TEM-1400plus 透射電子顯微鏡（日本電子株式會社），VE-180 電泳儀及電轉儀（上海Tanon 科技有限公司），MULTISKAN MK3 酶標儀（美國Thermo Scientific 公司），610C 凝膠成像系統（北京賽智創業科技有限公司），SKY-200B 搖床（上海蘇坤實業有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 動物模型制備 采用數字隨機分組法將ICR 小鼠分為5組，即空白組、模型組、升陽散火湯全方組（生甘草、防風、升麻、葛根、獨活、白芍、羌活、人參、柴胡、炙甘草）、補虛組（人參、芍藥、生甘草、炙甘草），升陽散郁組（升麻、葛根、柴胡、防風、羌活、獨活），每組10 只。除空白組外，采用單日進行束縛和力竭游泳，雙日進行夾尾和束縛[8]復制慢性疲勞動物模型，在整個試驗期間保持造模。

1.4.2 給藥方法 升陽散火湯按照 《內外傷辨惑論》原方中記載的用量為升麻、葛根、獨活、羌活、白芍藥、人參（以上各五錢），甘草（炙）、柴胡（以上各三錢），防風（二錢五分），甘草（生，二錢）通過度量衡換算，金代一兩約為現代 40 g，1 兩=10 錢=100 分，據此折算為現代劑量進行制備（升麻、葛根、獨活、羌活、白芍藥、人參各20 g，炙甘草、柴胡各12 g，防風10 g，生甘草8 g），按照小鼠與人的體表面積及原藥與顆粒劑比例折算小鼠的用藥劑量，升陽散火湯組給藥劑量為 2.73 g/kg、升陽散郁組給藥劑量為 1.57 g/kg、補虛組給藥劑量為 1.16 g/kg，每日1 次，連續灌胃4 周。

1.4.3 行為學測試 所有小鼠在造模第15 天、30 天、45 天進行稱質量記錄以及力竭游泳實驗和懸尾靜止實驗。

1.4.4 超微結構觀察 第45 天后，每組隨機各取3 只取材，進行形態學觀察。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后于右側后肢分離骨骼肌（腓腸肌），取約1 mm×1 mm×3 mm 大小組織塊。將取下骨骼肌標本置于3%戊二醛溶液中繼續固定48 h 后，進行固定、脫水、包埋、切片，采用透射電子顯微鏡TEM-1400 plus觀察骨骼肌的肌絲形態及線粒體超微結構變化。

1.4.5 Western blotting 分析 提取各組小鼠骨骼肌線粒體蛋白并用BCA 法進行蛋白定量，配制10%分離膠及濃縮膠，上樣后進行SDS-PAGE 電泳（80 V 30 min，120 V 60 min），濕轉法轉膜（180 mA 90 min，0.45 μm 孔徑PVDF 膜），5%脫脂牛奶封閉120 min后孵一抗4℃過夜，所用抗體為β-actin（1:30 000）、DRP1（1:500）、OPA1（1:1 000）、MFN1（1:500）。次日37 ℃孵二抗60 min，TBST 清洗3 次用ECL 化學發光液顯色并進行凝膠成像系統曝光。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，結果用均數±標準差（）表示。所有數據先經過方差齊性檢驗，方差齊采用多組單因素方差分析（One-way ANOVO），組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊采用非參數檢驗（Kruskal-Wallis）。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠行為學的影響

2.1.1 對慢性疲勞小鼠體質量的影響 與空白組比較，模型組小鼠體質量增長緩慢（P＜0.05）；給藥干預15、30 d 后與模型組比較，各組小鼠體質量差異無統計學意義。見表1。

表1 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠體質量的影響（，n =10） g

表1 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠體質量的影響（，n =10） g

注：與正常組比較，# P ＜0.05

2.1.2 對慢性疲勞小鼠力竭游泳時間的影響 各組小鼠造模15 d后，與正常組比較，模型組、升陽散火湯組、升陽散郁組、補虛組各組小鼠力竭游泳時間明顯減少（P＜0.05）；給藥干預15 d 后，與模型組比較，升陽散火湯組、補虛組力竭游泳時間明顯升高（P＜0.05）其中以補虛組的效果最明顯；給藥干預30 d 后與模型組比較，升陽散火湯組、補虛組、升陽散郁組力竭游泳時間均顯著升高（P＜0.05）。見表2

表2 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠力竭游泳時間的影響（，n =10） min

表2 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠力竭游泳時間的影響（，n =10） min

注：與正常組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.1.3 對慢性疲勞小鼠懸尾靜止時間的影響 各組小鼠造模15 d 后，與正常組比較，模型組、升陽散火湯組、升陽散郁組、補虛組各組小鼠懸尾靜止時間明顯增加（P＜0.05）；給藥干預15 d 后，與模型組比較，升陽散火湯組、升陽散郁組小鼠懸尾靜止時間縮短（P＜0.05）；給藥干預30 d 后，與模型組比較，升陽散火湯組及其拆方各組小鼠懸尾靜止時間縮短（P＜0.05）。見表3。

表3 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠懸尾靜止時間的影響（，n =10）

表3 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠懸尾靜止時間的影響（，n =10）

注：與正常組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.2 骨骼肌超微電鏡結果 空白組小鼠骨骼肌肌絲排列整齊，線粒體形狀規則，呈橢圓形，膜結構完整，內嵴清晰。模型組小鼠骨骼肌線粒體形狀不規則，膜溶解并相互連接，內嵴溶解缺失明顯，排列紊亂。全藥組小鼠骨骼肌肌節清晰，線粒體形態接近空白組，多呈橢圓形，膜結構較完整。升陽散郁組骨骼肌恢復程度不及升陽散火湯組，小鼠骨骼肌肌絲肌節欠清晰，明暗帶差異不明顯，線粒體多呈腫脹狀態，基質變淺。補虛組肌節欠清晰，部分肌絲溶解，線粒體恢復程度優于升陽散郁組。見圖1。

圖1 小鼠線粒體電鏡觀察結果

2.3 Western blotting 結果 結果顯示，與對照組比較，模型組線粒體融合相關蛋白MFN1、OPA1，線粒體分裂相關蛋白DRP1 表達水平顯著下調（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，升陽散火湯組、補虛組、升陽散郁組OPA1 蛋白表達水平顯著上調（P＜0.01），MFN 1 蛋白表達水平有上調趨勢；升陽散火湯組、升陽散郁組DRP1蛋白表達水平顯著上調（P＜0.05，P＜0.01），補虛組DRP1 蛋白表達水平下調（P＜0.05）。見圖2。

圖2 MFN1、OPA1、DRP1 蛋白表達結果

3 討論

慢性疲勞綜合征病程較長，病性以虛為主，或因虛致實，虛實夾雜。本研究從氣虛生郁，郁而生熱，內熱耗傷氣血的角度，選擇升陽散火湯及其拆方進行慢性疲勞的研究。升陽散火湯出自李東垣《內外傷辨惑論·卷中》“暑傷胃氣論”篇，是李東垣“火郁發之”之作，醫方考載“升麻、柴胡、羌活、獨活、防風、干葛，皆辛溫上行之物也，故用之以升少陽之氣，清陽既出上竅，則濁陰自歸下竅，而食物傳化自無抑遏之患；芍藥味酸，能瀉土中之木；人參味甘，能補中州之氣；生甘草能瀉郁火于脾，從而炙之，則健脾胃而和中矣”，其補氣藥與風藥結合，既可補而不滯，又可散而無傷，補中升陽，相須為用，被認為是中醫治法中“升陽散火”法的代表方。根據“法依病機、拆方依法”的拆方研究思路，可將升陽散火湯方拆分為兩大方群，即一為補脾土，生氣血（人參、白芍藥、生甘草、炙甘草）；二為升清陽，散郁火（升麻、葛根、柴胡、羌活、防風、獨活）。

慢性疲勞綜合征是一個漸進過程，目前對于此疾病的動物模型構建缺乏統一的制定標準，我們在查閱大量資料后發現，采用復合因素建立慢性疲勞動物模型更接近于慢性疲勞綜合征患者的臨床表現[10-11]。本實驗應激15 d 后，模型組小鼠較空白組的體質量及游泳時間明顯下降，懸尾靜止時間有增長趨勢，表明本實驗復制的疲勞動物模型符合慢性疲勞綜合征的主要行為學特點[12]。

從建模第2 周開始，慢性疲勞綜合征小鼠體質量明顯增長緩慢，與文獻報道[13-15]一致，說明束縛和強迫游泳可能造成小鼠產生類似慢性疲勞綜合征患者體形消瘦的癥狀。在實驗過程中升陽散火湯及其拆方各組小鼠體質量結果與模型組無差異，提示升陽散火湯及其拆方并不能增加慢性疲勞患者的體質量。力竭游泳時間被大多數研究者認為是能夠反映出動物體力情況和衡量機體疲勞程度的經典指標[16]。根據動物研究表明，升陽散火湯全方及拆方均可延長小鼠游泳至力竭的時間，且短期內（給藥2 周）補虛組效果更佳，長期（給藥4 周）的慢性疲勞升陽散火湯全方效果更佳。提示長期慢性疲勞患者當以補虛與升陽散郁結合治療的中醫思路。在給藥2 周時，補虛組對力竭游泳的指標改善作用優于升陽散火湯組和升陽散郁組，進一步提示短期慢性疲勞患者使用補虛法，可以起到最佳治療效果。尾懸實驗不僅能體現出小鼠的體力情況，還能體現出小鼠的情緒狀態。本研究發現，模型組小鼠懸尾靜止時間長于正常小鼠，與文獻[13-15]報道一致。提示模型組小鼠體力下降，心理絕望感增加，升陽散火湯治療30 d 后慢性疲勞小鼠的懸尾不動時間顯著減少，提示升陽散火湯治療后的小鼠體力較好，心理適應性較強。

本實驗研究采用透射電鏡觀察疲勞對于小鼠骨骼肌線粒體結構損傷，發現慢性疲勞小鼠的骨骼肌及線粒體損傷嚴重，不易恢復，升陽散火湯可更好地保護骨骼肌及其線粒體膜結構的穩定性。本研究發現，模型組線粒體融合相關蛋白OPA1、MFN1，線粒體分裂相關蛋白DRP1 表達量顯著下降，表明慢性疲勞可抑制小鼠骨骼肌線粒體分裂和融合，引起線粒體功能障礙。各給藥組線粒體融合、分裂相關蛋白均有不同程度的調節，表明升陽散火湯及其拆方均可調控線粒體分裂和融合，增強線粒體功能以滿足機體對能量的需求。

本研究結果表明，升陽散火湯及其拆方均具有提高小鼠抗疲勞能力。但從長期給藥治療的角度，單獨補虛或者升陽散郁抗慢性疲勞效果均較整方差，提示李東垣升陽散火的治療思想對慢性疲勞綜合征的臨床治療具有實際意義。