銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素異質性耐藥的研究進展

劉宇陽，陳 茶，黃 彬

(1. 中山大學附屬第一醫院檢驗科，廣東 廣州 510080； 2. 廣州中醫藥大學第二附屬醫院檢驗科，廣東 廣州 510120； 3. 廣東省中醫院檢驗科，廣東 廣州 510120)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是引起醫院感染的主要條件致病菌[1]。隨著抗菌藥物的廣泛使用，PA耐藥情況越來越嚴重，常常出現多重耐藥和泛耐藥PA，導致嚴重且難以治療的醫院獲得性感染[2]。免疫力低下患者對PA具有較高的易感性，PA引發的感染在該類人群中可導致較高的病死率[3]。

異質性耐藥(heteroresistance, HR)現象在1947年首次被發現于革蘭陰性細菌流感嗜血桿菌[4]中，20年后在革蘭陽性細菌葡萄球菌中再次被觀察到，但直至1970年“異質性耐藥”的概念才明確被提出。臨床上常根據微生物自動化檢測儀的藥敏結果選擇抗菌藥物治療病原菌感染。HR菌株因難以被常規方法檢出而漏檢，在抗菌藥物的選擇壓力下可能導致高水平亞群的出現，造成臨床治療失敗和感染復發。隨著碳青霉烯類抗生素應用增加，其相關的HR日益增多。目前，肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌等臨床常見病原菌[5-11]對碳青霉烯類抗生素的異質性耐藥已有較多研究[12]，但關于碳青霉烯類異質性耐藥銅綠假單胞菌(carbapenem-heteroresistantPseudomonasaeruginosa, CHPA)的相關報道較少。嚴格控制碳青霉烯類藥物的使用對于減少PA感染者CHPA的發生至關重要。研究[13]表明，2011—2015年CHPA的分離率呈逐年上升趨勢，我國西南地區已廣泛發現CHPA菌株，在侵襲性PA中，CHPA的檢出率高達84.9%。CHPA的耐藥機制至今尚未得到充分研究，CHPA的檢測和鑒定也缺乏統一的標準。本文對CHPA的研究現狀包括HR定義、檢測方法、CHPA耐藥機制、臨床及流行病學特征進行綜述，為臨床診斷與治療CHPA感染提供新思路。

1 HR的定義

HR指同一克隆菌株中同時存在對某種抗菌藥物耐藥及敏感亞群的現象，即體外藥敏試驗如K-B法檢測細菌對某種抗菌藥物的敏感性時，在抑菌圈內有相同種屬的菌落生長[14]。有臨床意義的表型主要體現為大部分亞群敏感，但有一小部分亞群耐藥，極少數亞群甚至出現高水平耐藥。常規劑量抗菌藥物作用下，這部分耐藥亞群不能被殺死，可能導致臨床應用抗菌藥物治療失敗[14-15]。

在研究PA的HR過程中，需要考慮以下幾點：第一，耐藥亞群的耐藥水平。大多數研究采用最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)與最高不抑菌濃度(the highest noninhibitory concentration, HNIC)的比值表示耐藥亞群的耐藥水平[16]。研究顯示，不同細菌的異質性耐藥水平略有差異。例如，鮑曼不動桿菌、PA和肺炎克雷伯菌的MIC和最高不抑菌濃度的比值>8時，判定為HR[1,17]；陰溝腸桿菌的MIC和最高不抑菌濃度的比值>2時，判定為HR[18]。第二，耐藥亞群頻率。耐藥亞群頻率常用耐藥亞群細菌數占細菌總數的百分比表示，即大于8倍MIC濃度的抗菌藥物平板上生長的菌落數占無抗菌藥物平板上生長的細菌總數的百分比。耐藥亞群頻率的檢測極限在10-7甚至更低，不同檢測方法的敏感性有所差異[19]。因此，有必要報告大于8倍MIC濃度抗菌藥物平板的耐藥亞群頻率。第三，HR的穩定性。穩定性是指異質性耐藥亞群在無抗菌藥物培養基中連續傳代后恢復親代菌株耐藥水平的能力。穩定性直接關系到HR的檢測水平。在Wong等[20]的研究中耐萬古霉素葡萄球菌HR是穩定的，而部分研究[21]中HR是不穩定的。CHPA通常表現為穩定的HR[22-23]。

綜上所述，在HR中，除了關注耐藥亞群的存在，還應關注耐藥水平、耐藥頻率和HR穩定性。

2 HR的檢測方法

傳統的微生物藥敏試驗不能識別出具有HR的菌株，導致HR漏檢并可能導致抗菌藥物治療的失敗。因此，及時、準確地檢測HR菌株對于其所致感染的治療非常重要。然而，HR的檢測至今沒有標準化方法，各實驗室的檢測方法也各有差異。常規的HR檢測方法有改良K-B法、E-test法和菌群譜型分析法[24]三種。近年來也開發出一些新的檢測和輔助檢測方法，如PAP曲線下面積法(PAP-AUC)[25]、時間殺傷試驗法[26]、毛細管電泳法[27]以及全基因組測序法[28]等。

2.1 改良K-B法和E-test法 K-B法和E-test法常用于臨床藥敏試驗，分別檢測細菌對抗菌藥物的抑菌圈直徑和MIC值。采用這兩種方法在抑菌圈內通?？芍庇^發現可能存在的HR菌落，但假陰性概率較高。為了增加HR的檢出率，Andersson等[29]對美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)公布的藥敏紙片擴散法進行了適當修改，即將菌液接種濃度從0.5增加到2.0麥氏單位，并將溫箱孵育時間從24 h增加到48 h。具體方法為：將菌液調至2.0麥氏單位后，均勻涂布于M-H平板，貼相應的藥敏紙片或E-test試條，37℃孵育48 h后觀察結果[25]。該方法有效降低了HR檢測的假陰性率。研究[21]表明，改良K-B法和E-test法仍存在較高的假陰性，只能用于HR的初篩。

2.2 菌群譜型分析法 菌群譜型分析法(population analysis profiling, PAP)被認為是HR檢測的金標準[14]。將過夜培養的菌液濃度調節至1.0×107CFU/mL，取20 μL涂布于梯度抗菌藥物(具體濃度根據細菌MIC而定，如PA對美羅培南MIC折點值為2～8 mg/L[30]，則可選擇梯度抗菌藥物板濃度為0.5～32 mg/L)平板上，37℃孵育48 h后計數菌落，其HNIC與MIC濃度比值大于8，則判定為HR。PAP結果可以提供耐藥亞群頻率和MIC等信息，但過程非常繁瑣，通常只用于實驗室研究和一些特殊臨床病例。改良PAP方法采用微量稀釋滴定[31](取微量菌液滴定于抗菌藥物滴度平板，不涂布均勻，觀察細菌是否生長)，在節約成本的基礎上，提高了HR的檢出效率，但由于滴定的菌量相對較小，也可能存在假陰性。PAP是檢測異質性耐藥最可靠的方法，但由于其高成本和低效率的特點，在臨床應用中難以實施。

2.3 PAP-AUC PAP-AUC是一種改良的PAP，有研究將PAP-AUC作為檢測異質性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌(heteroresistant vancomycin-intermediateStaphylococcusaureus, hVISA)的金標準[32]。具體操作如下：將過夜培養的菌液調節至1.0×107CFU/mL，取100 μL涂布于含有0.5、1、2、2.5和4 mg/L萬古霉素的腦心浸液(brain heart infusion, BHI)平板上。在37℃孵育48 h后進行菌落計數，并使用GraphPad Prism軟件將存活細菌數與萬古霉素濃度作AUC曲線圖，計算曲線下面積[25]。與PAP相比，PAP-AUC操作更為繁瑣，成本主要由篩選試驗后所需的PAP-AUC檢測次數決定。

2.4 時間殺傷試驗法 在時間殺傷試驗(time-killing assay)中，細菌在抗菌藥物作用下，敏感菌群被殺死，但耐藥亞群不斷繁殖，會出現菌落數先下降后增加的現象[33]。將過夜菌培養液濃度調節至大于1.0×105CFU/mL，在0.5～4倍MIC值梯度抗菌藥物濃度作用下，通過記錄2、4、6、8、10、12、24和48 h抗菌藥物作用下細菌數量的變化作時間殺傷曲線來判讀結果。時間殺傷曲線法可以作為HR的驗證方法，但其靈敏度和準確度不及PAP，過程也相對繁瑣，不適用于臨床檢測。此外，時間殺傷曲線法還可以用于檢測抗菌藥物聯合應用的療效，評估聯合用藥的協同作用[34]。

2.5 毛細管電泳法 有研究表明毛細管電泳法(capillary electrophoresis, CE)可快速檢測革蘭陰性細菌對粘菌素的HR亞群。研究表明，CE法可以根據細菌的表面特性分離不同的菌株。通過簡單的CE運行，只需幾分鐘，便能清楚地檢測出細菌亞群是否共存[27]。這種新興的細菌亞群檢測技術尚未成熟，有待研究并應用于HR的檢測。

2.6 全基因組測序法 全基因組測序法(whole genome sequencing, WGS)已應用于細菌亞群的分析。通過分析耐藥亞群基因型的變化，檢測出HR。研究[28]表明在金黃色葡萄球菌和結核分枝桿菌中，WGS的準確度高于傳統表型檢測，但在耐藥亞群頻率小于10-2時靈敏度不高。也有研究[35]表明WGS不能準確檢測出腸道沙門氏菌的HR亞群。全基因組測序的分析相對復雜，對生物信息學有較高的依賴性，尚未應用于臨床檢測。

綜上所述，為了防止CHPA的臨床治療失敗和耐藥菌株的傳播，有必要規范PAP的操作流程，并發展出更高敏感性、更高重復性和簡便的新興檢測技術(例如，在同一M-H平板中設置不同抗菌藥物梯度形成梯度抗菌藥物平板等[29])用于臨床試驗。

3 CHPA的異質性耐藥機制

HR菌株難以被臨床微生物自動化儀器檢出，長期用藥可能導致高水平耐藥亞群的出現，造成臨床治療失敗和感染復發。因此，研究HR機制對耐藥性監測和患者預后至關重要。自1947年首次發現HR現象以來，幾乎在所有革蘭陽性菌和革蘭陰性細菌中都發現了HR。臨床分離的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物均具有明顯的異質性耐藥；但只有少數文獻報道了可能與CHPA相關的耐藥機制，例如，生物膜形成、外排泵MexAB、MexCD的高表達和膜孔蛋白OprD的缺失等[36-38]。AmpC過表達與CHPA的關系尚有爭議，Cabot等[37]認為AmpC過表達是CHPA最主要的機制，而He等[13]則認為AmpC可能不參與PA的HR。

機制研究表明，外排泵系統的過表達和膜孔蛋白的表達下調可能是PA對碳青霉烯類抗生素異質性耐藥的主要機制。PA通過阻止抗菌藥物進入細菌或增加抗菌藥物的排出，以達到對抗菌藥物耐藥的目的。

3.1 外排泵系統的過表達 Ikonomidis等[36]指出CHPA的機制與外排泵基因表達上調有關。與親代菌株相比，HR菌株外排泵相關基因包括mexB、mexC、mexE和mexX的表達都出現上調。值得注意的是，亞胺培南異質性耐藥(imipenem heteroresistance, IPM-HR)菌株中mexB和mexE均表現出明顯上調，美羅培南異質性耐藥(meropenem heteroresistance, MPM-HR)菌株中mexE表現為明顯上調，而mexB與親代菌株水平無明顯差異。這一現象可能是由于亞胺培南的化學結構中缺乏一個可以被MexAB-OprM系統識別的雜環側鏈[38]。

3.2 膜孔蛋白OprD基因表達下調 PA的HR亞群還表現出OprD基因和蛋白的表達顯著降低[36]。外排泵的上調和OprD基因的下調在一定程度上都促進了CHPA對碳青霉烯類抗生素HR的產生[38-39]。

3.3 生物膜的形成 大量研究[13]表明，所有CHPA的生物膜都明顯增加。生物膜延緩了抗菌藥物的滲透，降低了微生物的生長速度，從而促進了具有不同抗性水平的亞群在細菌群體中的出現。生物膜的檢測一般分為定性法和定量法兩種，定性法是指利用熒光顯微鏡、相差顯微鏡或者掃描電鏡觀察細菌生物膜形態，定量法指半定量結晶紫法或者生物膜內的活菌計數法等。前者較后者更為直觀。

另外，He等[13]通過PCR檢測CHPA分離株是否產金屬β-內酰胺酶(metallo-β-lactamase, MBLs)，發現CHPA中MBLs基因型陰性[5]，與一般耐藥機制不同。這與吳婷婷關于銅綠假單胞菌亞胺培南異質性耐藥機制的研究結果一致[34]。因此，CHPA的耐藥機制可能與外排泵系統、膜孔蛋白以及生物膜的產生有關，與MBLs的產生無關。

4 CHPA的臨床及流行病學特征

盡管CHPA在世界范圍內已被觀察到，但其流行病學資料不多[40]。在我國CHPA感染患者中，IPM-HR(41.9%，189/451)和MPM-HR(72.5%，327/451)分離株所致感染比例較高。IPM-HR分離株的分離率2011年為41.7%，2015年增加至62.1%，MEM-HR分離率也出現了上升趨勢[13]。馬幸延等[41]檢測了169株臨床分離的 PA對多種抗菌藥物的藥敏情況，檢出并確認了50株CHPA菌株，檢出率為29.59%。其中MPM-HR株和IPM-HR株的檢出率分別為26.04%(44/169)和13.02%(22/169)，同時對這兩種抗菌藥物均異質性耐藥的菌株檢出率為 9.47%(16/169)。如前所述，常規臨床藥敏試驗難以檢測出HR的存在，HR菌株通常被判定為敏感菌株[42]。在PA的感染中，這將導致HR亞群用常規劑量碳青霉烯類抗生素治療失敗。

5 小結與展望

目前，碳青霉烯類抗生素已成為治療PA感染的主要抗菌藥物，隨著用藥率的增加HR亞群頻率也出現上升。為控制CHPA的感染和傳播，使用抗菌藥物應遵循以下兩種方式：第一，換用無HR現象的敏感抗菌藥物，以較低的劑量達到抗菌目的；第二，聯合用藥，利用協同效應達到治療效果。兩種方式中應優先考慮前者。

HR機制十分復雜，至今尚未明確。HR可能是細菌自然進化的工具，因為其為細菌提供了在抗菌藥物壓力下繼續生存的機會[43]。深入和全面地了解CHPA耐藥機制，將有助于指導臨床合理用藥，減少臨床碳青霉烯類抗生素治療PA感染的失敗。PAP作為檢測HR的金標準，有必要簡化其檢測流程，例如，采用微量稀釋滴定PAP或者設計梯度抗菌藥物PAP平板，標準化PAP操作流程。同時，發展高效快速的新興檢測技術，為臨床診斷和治療CHPA感染提供參考，減少住院患者CHPA的感染和傳播。