環二鳥苷酸在生物膜形成中作用的研究進展

馮 媛， 王 惠， 王崇剛

作者單位： 山西醫科大學第二附屬醫院感染性疾病科，太原030001。

耐藥細菌的不斷出現和傳播嚴重威脅人類健康[1]。生物膜是導致耐藥的一種重要機制，并且多數細菌感染與之相關。生物膜通過一系列不同的機制，使生物膜內的細菌對抗生素和消毒劑的抵抗能力顯著高于浮游菌，如生物膜基質對抗生素的抗滲性、生物膜核心部位細菌的生長速率降低、存在耐受抗生素的持留菌和生物膜內細菌外排泵過表達，并引起持續感染，是治療失敗的主要原因[2]。臨床觀察和實驗研究表明，大多數情況下，僅抗生素治療不足以根除生物膜感染[3]，因此抑制生物膜形成的藥物將是目前臨床治療中的重要補充[4]。環二鳥苷酸[Bis-（3'， 5'） cyclic diguanylic acid, c-di-GMP]是一種普遍存在于細菌中重要的第二信使，在協調細菌生長和行為各個方面均有重要作用，包括運動、毒力、生物膜形成和細胞周期等[5]。干擾和調節c-di-GMP可能是控制生物膜形成的重要措施。本綜述對c-di-GMP結構、功能、調節，在生物膜形成中的作用及相關治療作介紹。

1 c-di-GMP結構、調節、功能

c-di-GMP是環二核苷酸 （CDN）中最早被發現、研究最多、作用廣泛且普遍存在的細胞內信號分子[5]。最初在木糖葡糖桿菌中作為纖維素合成酶的變構激活劑被人類發現并定義[6]，隨后在大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等細菌中均有發現。c-di-GMP單體具有兩重對稱性，兩個GMP基團由一個5'，3'大環融合而成。c-di-GMP介導的信號轉導系統包括四部分，即合成c-di-GMP的二鳥苷酸環化酶（DGC）、降解c-di-GMP的磷酸二酯酶（PDE）、c-di-GMP效應分子及受效應分子直接調控的下游靶標[7]。細菌內存在與c-di-GMP代謝酶結構類似并且具有感受結構域的分子，可以感知細菌內外信號，調節c-di-GMP代謝酶活性，進而影響c-di-GMP水平。不同水平c-di-GMP通過介導其效應分子及下游靶標發揮作用，參與細菌多種生理功能。目前已經被鑒定的c-di-GMP效應分子有mRNA核糖開關、轉錄調節因子、含有PilZ結構域的蛋白質、以及含有退化的GGDEF和EAL結構域的蛋白質。

細菌內c-di-GMP水平受到DGC和PDE嚴格調控，并且這種調控既有全局層面又有局部層面[7]。一般來說，低/高水平c-di-GMP分別與細菌的運動和生物膜形成相關。c-di-GMP由DGC催化2分子GTP縮合形成，并通過PDE水解為2分子GMP或線性pGpG。PDE含有EAL或HD-GYP結構域，而大部分DGC具有GGDEF結構域，該結構域上存在DGC的催化活性位點（A-site）和變構結合位點（I-site）。當c-di-GMP以二聚體形式與I位點結合，DGC的活性受到產物非競爭性抑制，這有助于維持c-di-GMP水平的穩定[8]。

生物膜形成是細菌感染遷延不愈的主要原因。體外研究表明外源性c-di-GMP可以抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成，但無明顯抗微生物活性。然而Brouillette等[9]卻發現c-di-GMP在體內具有抗微生物活性，可以減少小鼠乳腺炎模型中金黃色葡萄球菌的定植，并呈劑量依賴性，200 nmoL c-di-GMP基本可以清除乳腺中的金黃色葡萄球菌[乳腺組織中菌落形成單位（CFU）減少為原來的萬分之一，P＜0.001]。c-di-GMP具有抗微生物活性可能是其在體內引起宿主免疫應答的結果，Karaolis等[10]的研究為此提供了依據，他們提出c-di-GMP是一種免疫刺激分子，可以觸發固有和適應性免疫應答。與之前實驗不同，該研究通過用c-di-GMP對小鼠乳腺預處理（細菌接種前12 h和6 h），發現對金黃色葡萄球菌感染有顯著的保護和預防作用（乳腺組織中CFU減少為原來的萬分之一，P＜0.001），認為該保護作用可能是c-di-GMP觸發固有免疫應答的結果。隨后進一步研究了c-di-GMP對宿主免疫應答的影響，基于以下發現，提出c-di-GMP可以觸發Th1細胞免疫應答：c-di-GMP可以激活人樹突細胞的p38MAPK信號通路，誘導樹突細胞的成熟（表達成熟標志物、招募效應細胞、刺激T細胞增殖）；另外c-di-GMP還具有佐劑潛力，可以顯著提高抗體滴度，以IgG2a為主，并在小鼠細菌性肺炎模型再次證明c-di-GMP可以觸發固有免疫應答[11]。Zhao等[12]進一步發現c-di-GMP預處理也可以減少鮑曼不動桿菌在小鼠模型的肺部定植，并且是通過誘導MCP-1等趨化因子，招募嗜中性粒細胞介導的。目前對c-di-GMP調控免疫的研究十分有限，但c-di-GMP的免疫調控功能將有望在對抗細菌感染方面發揮重要作用。

2 c-di-GMP在生物膜形成各階段的作用

典型的生物膜形成周期包括四部分：①細菌附著在生物或非生物表面上；②細菌失去運動能力，開始產生生物膜基質，形成生物膜；③生物膜成熟和增厚；④生物膜擴散（隨著生物膜的老化，細菌從生物膜中擴散，恢復到浮游狀態，生命周期重新開始）。生物膜的形成存在多種調節機制，其中c-di-GMP在生物膜的形成和細菌運動中起著至關重要的作用，一直是研究關注的焦點。生物膜的形成過程包括表面附著、運動控制[游泳（swimming）、群集運動（swarming）、顫動（twiching）]、生物膜基質的產生、生物膜擴散，這些都與c-di-GMP水平有關[13]。

2.1 附著與運動

細菌在表面的初始可逆附著需要依靠不同運動方式來實現。細菌在水溶性/半固體/非生物表面的運動方式分別是游泳、群集、顫動。鞭毛和菌毛是介導這三種運動方式的細胞器，它們的合成、組裝及功能均受到c-di-GMP高度調節。轉錄因子FleQ是一種細菌AAA+ATP酶增強結合蛋白，是銅綠假單胞菌鞭毛基因的主要激活因子，當c-di-GMP高水平時，c-di-GMP與ATP競爭結合FleQ使其ATP酶活性降低，抑制鞭毛基因轉錄[14]。Trampari等[15]發現c-di-GMP可以調控鞭毛的輸出，鞭毛的輸出裝置由6個膜蛋白和3個可溶性蛋白FliI與FliH和FliJ構成，其中FliI ATP酶活性對鞭毛輸出裝置的啟動有重要作用，而c-di-GMP與FliI結合進而抑制鞭毛的輸出。c-di-GMP通過對細菌運動功能調控進而介導表面黏附及生物膜擴散。例如，大腸埃希菌和腸血清型傷寒沙門菌，c-di-GMP通過效應分子YcgR（PilZ結構域的蛋白質）調控游泳運動。高水平c-di-GMP與YcgR結合，并以結合形式與鞭毛馬達定子MotA相互作用，影響馬達運轉及能量產生，進而抑制游泳運動，而細菌內PdeH（PDE）可以水解c-di-GMP，使其處于低水平來維持游泳運動[16]。類似的機制在枯草芽孢桿菌也存在[17]。群集運動是由鞭毛和菌毛共同介導的，YcgR類似物FlgZ通過調控銅綠假單胞菌鞭毛控制群集運動，高水平c-di-GMP與FlgZ結合，并與鞭毛定子MotC的相互作用，阻止鞭毛定子復合物MotCD與轉子接觸來抑制群集運動[18]。c-di-GMP代謝酶SadC、SadB、BifA均與群集運動有關，sadB位于sadC下游，研究發現sadC、sadB基因缺失會導致群集運動上調，相反bifA基因缺失引起群集運動喪失，目前認為SadC、BifA可能共同調節c-di-GMP水平，進而通過SadB控制群集運動[19-20]。銅綠假單胞菌的顫動是由菌毛通過延伸、附著、收縮的循環介導。過去發現具有GGDEF-EAL結構域的FimX與顫動有關[21]，最近研究發現c-di-GMP通過與FimX和PilZ形成三聚體復合物調控菌毛生成，進而控制顫動[22]，但具體機制仍不清楚。

2.2 生物膜基質的產生

初始附著后，細菌增殖并產生生物膜基質形成成熟的生物膜。生物膜基質在不同細菌中成分存在差異。c-di-GMP在生物膜基質的不同成分產生過程中發揮調控作用，如銅綠假單胞菌已鑒定的生物膜基質成分主要有多糖Psl、Pel和海藻酸鹽。轉錄因子FleQ與c-di-GMP的結合形式激活pel和psl基因轉錄，并且這些多糖受到PelD（一種退化的GGDEF結構域蛋白）以及幾種DGC和PDE酶在翻譯后調控[14,23]。海藻酸鹽不是生物膜形成的必需成分，但由于其能維持細胞水化，在限制水的條件下是生物膜形成所必需的組成部分[24-25]，因此，在肺囊性纖維化感染中起關鍵作用。研究發現肺囊性纖維化患者的氣道呈脫水狀態，這會促使銅綠假單胞菌從非黏液表型轉化為產生海藻酸鹽的黏液表型，引起患者肺功能和生存率的下降[26]。由此可見抑制海藻酸鹽的生成有助于控制肺囊性纖維化患者的感染，并改善預后。海藻酸鹽是由多種蛋白復合物參與合成的，其前體經內膜蛋白Alg8和Alg44（PilZ結構域蛋白）聚合，在細胞周質被多種蛋白修飾及裝運，隨后被分泌出細胞外發揮作用。過去研究發現c-di-GMP與Alg44結合可以激活海藻酸鹽的合成，而這種激活依賴另一種內膜蛋白MucR（混合的EAL-GGDEF結構域蛋白）對局部c-di-GMP水平的調節。最近研究發現MucR介導硝酸鹽依賴的海藻酸鹽合成，并且GGDEF和EAL結構域對于海藻酸鹽的合成均有重要作用[27]。

大腸埃希菌的生物膜基質卷曲纖維、纖維素和（β-1,6-N）-乙酰氨基葡萄糖（PGA）的合成也受到c-di-GMP調節。其中纖維素的合成過程存在c-di-GMP全局層面與局部層面的調控。RpoS（σ因子）誘導DgcE表達上調和PdeH的連續下調，引起細菌c-di-GMP整體水平升高。DgcM和PdeR構成局部控制模塊，主要感應c-di-GMP水平升高，并激活轉錄因子MlrA，而非調節c-di-GMP水平[28]。活化的MlrA會激活中央卷曲調節器CsgD，進而誘導卷曲基因和dgcC的表達，前者合成卷曲纖維，后者合成DgcC使c-di-GMP局部水平升高，進而c-di-GMP通過與纖維素合成酶BcsA-BcsB結合使之變構激活合成纖維素[29]。PGA存在于多種細菌的生物膜基質中，在大腸埃希菌中發現后被命名為PGA，可以促進表面黏附和生物膜形成[30]。PGA的合成、分泌都需要c-di-GMP對PGA復合物變構激活。該復合物包括兩種跨膜組分PgaA和PgaB，兩種內膜組分PgaC和PgaD。pgaA基因（編碼PGA復合物）以及編碼DgcT和DgcZ兩個DGC分子的基因dgcT和dgcZ都由Csr（carbon storage regulation system）控制，這是一個介導大腸埃希菌多種生理功能的碳儲存調節系統，包括CsrA、CsrB、CsrC，其中CsrA對上述基因起抑制作用，而CsrB、CsrC對CsrA也存在抑制作用[31]。組氨酸激酶BarA受短鏈脂肪酸（醋酸或富馬酸）的刺激，通過應答調節因子UvrY的磷酸化激活兩個sRNA CsrB和CsrC的表達，抑制CsrA，從而使pgaA、dgcT、dgcZ基因表達，c-di-GMP水平升高，合成并分泌PGA。最近研究表明PgaCD是一種新型c-di-GMP受體，c-di-GMP可以直接與PgaC和PgaD結合激活PGA合成及分泌[32]。

2.3 生物膜擴散

隨著生物膜老化，生物膜內的細菌擴散為浮游菌，并在其他地方形成生物膜，導致感染的遷延和慢性化，但浮游菌恢復了對抗生素的敏感性，有利于發揮抗生素治療效果清除病原菌及病灶。這將為治療生物膜相關感染提供一個新的思路。Morgan等[33]認為生物膜擴散是一個動態的、受到高度調控的過程，其由特定的環境信號觸發，并受尚未表征的基因分層控制。Christensen等[34]通過過表達磷酸二酯酶基因yhjH，證實降低c-di-GMP水平可引起生物膜在體內外擴散。而一氧化氮（NO）和谷氨酸也被證明可以引起生物膜擴散，并與低水平c-di-GMP有關。進一步研究發現dipA、rbdA、bdlA基因在NO或谷氨酸誘導生物膜擴散中具有重要作用，但細菌如何感知環境信號（如NO），以及該信號如何引起c-di-GMP水平變化進而調控生物膜擴散尚不了解。最近研究發現在谷氨酸誘導擴散模型中，NicD可以感知谷氨酸信號，引起c-di-GMP水平升高進而順序激活BdlA（一種傳感器蛋白）和DipA（GGDEF-EAL結構域蛋白），最終引起c-di-GMP水平降低介導生物膜擴散[35]。對于c-di-GMP調控的生物膜擴散可能存在兩種情況：①依賴游泳運動的主動逃逸，這與鞭毛基因表達上調及菌毛基因表達下調有關；②生物膜黏附性降低及生物膜基質合成減少引起的被動脫落[33]。Chatterjee等[36]在熒光假單胞菌中發現c-di-GMP調控黏附素LapA介導生物膜擴散。LapA結合在細胞膜上，介導表面黏附，維持生物膜穩定；LapG是一種周質蛋白酶，可切割LapA；LapD是一種跨膜蛋白，可調節LapG的活性。高水平c-di-GMP可與LapD結合，將LapG隔離在周質中使其不能切割LapA進而發揮黏附素作用。但c-di-GMP與磷酸鹽水平相關，當磷酸鹽不足時，c-di-GMP水平因RapA（PDE）表達而降低，LapD失活，LapG釋放并切割LapA，促進生物膜擴散。目前關于c-di-GMP在生物膜擴散中機制研究尚較少，但是依據c-di-GMP在運動調節以及生物膜基質產生中發揮的作用，推測它在生物膜擴散中的作用必不可少。已經證實調節c-di-GMP水平，誘導生物膜擴散可以作為一種感染控制策略，接下來需要大量實驗加以佐證及深入研究，希望成為解決生物膜感染的一條途徑。

3 c-di-GMP與生物膜治療

c-di-GMP介導的信號通路與細菌的多種生理功能密切相關，因此，調節c-di-GMP水平、阻斷其信號傳導對于研發新型抗菌藥物具有重要意義。目前阻斷c-di-GMP信號傳導有三類潛在靶點，即c-di-GMP合成酶抑制劑、c-di-GMP降解酶抑制劑、c-di-GMP受體抑制劑[7]。如，Sambanthamoorthy等[37]利用霍亂弧菌中高水平c-di-GMP抑制熒光素酶 VC1673-lux表達這一特性，篩選出7個能抑制霍亂弧菌生物膜形成的雙鳥苷酸環化酶抑制劑，其中一個分子DI-3表現出廣譜抗生物膜活性。該研究者通過基于藥效基團的高通量方法篩選出4個雙鳥苷酸環化酶抑制劑，發現其不僅可以抑制生物膜形成，還可以使已經形成的生物膜擴散[38]。目前還未發現c-di-GMP降解酶抑制劑和c-di-GMP受體抑制劑存在抗生物膜作用。另外，PDE激活劑可通過降解c-di-GMP誘導生物膜擴散，Christensen等[34]證明此概念。NO在亞致死濃度下可通過結合NO敏感 H-NOX結構域蛋白，激活PDE而誘導多種細菌擴散，并且硝基氧化物（NO供體）與環丙沙星結合使用可有效地根除生物膜[39]。小劑量NO吸入在感染銅綠假單胞菌的肺囊性纖維化患者中可明顯減少生物膜并提高治療效果[40]。以上研究說明NO作為PDE激活劑，與抗生素聯合使用可能是治療生物膜相關感染的可行方法。但是需要探索安全、有效的誘導生物膜擴散的藥物，然而，并不是所有的PDE都能調控生物膜的擴散，重要的是確保激動劑正確地激活具有已知擴散作用的PDE。此外，鑒于c-di-GMP可以觸發先天免疫和適應性免疫反應，具有預防和控制感染的作用，c-di-GMP將有望成為疫苗，在預防和控制感染方面發揮重要作用。

4 總結

生物膜的形成使細菌能夠適應各種不利的環境，因此也對臨床上治療造成極大困擾。近年來研究發現c-di-GMP通過與多種效應分子相互作用形成一個信息網絡，參與并影響細菌的代謝及多種生理功能，尤其是在生物膜形成中，因此c-di-GMP可以作為抗生物膜藥物的作用靶點。到目前為止，c-di-GMP對生物膜形成等多種生理功能的具體調控通路仍不明確,并且c-di-GMP的免疫調節功能、生物膜擴散、c-di-GMP抑制劑方面研究較少，仍需大量研究探索及佐證，這將可以對生物膜引起的感染提供一個治療新思路。