表達(dá)重組包涵體蛋白的變性溶解及復(fù)性研究

高應(yīng)瑞，劉珂飛

（天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司 300384）

1 包涵體蛋白溶解

尿素，鹽酸胍和強(qiáng)離子洗滌劑如N-月桂酰肌氨酸是最常用的溶解劑。在變性劑溶液中溶解包涵體可能是一種已經(jīng)很明確的方法，但是可能聚合可溶性低聚物。鮮為人知的是，在變性溶液中可能會(huì)形成聚合物。在變性劑溶液中，由于離子變性的作用，在蛋白復(fù)合物之間產(chǎn)生強(qiáng)大的靜電斥力，進(jìn)而將包涵體分散為單分子結(jié)構(gòu)[1]。

通常情況下，濃度為6～8M的尿素和6～7M的鹽酸胍可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的溶解。然而，即使在濃度最高的情況下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生的相互作用往往也可導(dǎo)致非天然結(jié)構(gòu)的形成，在變性劑含量降為中等濃度時(shí)，其（尿素和鹽酸胍）與蛋白質(zhì)的結(jié)合力也降低，因此，蛋白質(zhì)分子開(kāi)始重新折疊。因此，它有可能通過(guò)調(diào)節(jié)鹽酸胍和尿素的濃度來(lái)調(diào)節(jié)其與蛋白的結(jié)合力，以至于使復(fù)性過(guò)程更加有效。這種情況不包括洗滌劑在內(nèi)。洗滌劑與蛋白的結(jié)合力決定于其臨界膠團(tuán)濃度(CMC)的大小。這種膠團(tuán)結(jié)合往往在臨界膠團(tuán)濃度之上，即變性非折疊蛋白溶解性好的條件下發(fā)生，而這種膠團(tuán)結(jié)合不能或者很少能在臨界膠團(tuán)濃度之下，即蛋白溶解性差的條件下發(fā)生[2]。

這表明，只有在洗滌劑存在的條件下，蛋白復(fù)性過(guò)程才能發(fā)生，否則，去除洗滌劑后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和溶解度又將形成原包涵體。

2 蛋白復(fù)性

復(fù)性過(guò)程是蛋白質(zhì)構(gòu)象從展開(kāi)狀態(tài)到折疊狀態(tài)的變化過(guò)程。包涵體只能由強(qiáng)變性劑溶解，使其蛋白質(zhì)呈展開(kāi)狀態(tài)，其溶解程度主要取決于蛋白質(zhì)本身及其所使用的變性劑類型。包涵體經(jīng)過(guò)變性劑溶解后的蛋白質(zhì)為高度可溶性。與純化的蛋白復(fù)性研究不同，包涵體溶解蛋白含有蛋白表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的雜質(zhì)，其可能干擾蛋白質(zhì)的復(fù)性。因此，為了減少雜質(zhì)對(duì)復(fù)性過(guò)程的干擾，可以先對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。

以下，我們分別描述了這兩個(gè)參數(shù)，但在復(fù)性過(guò)程中，應(yīng)結(jié)合這兩個(gè)參數(shù)尋求最佳優(yōu)化條件。首先，我們討論減少變性濃度的各種方式。

2.1 分步透析復(fù)性

該透析方法來(lái)降低變性劑濃度已成功應(yīng)用于抗體蛋白的復(fù)性[3，4]。首先將展開(kāi)蛋白樣品置于高濃度變性劑溶液中，然后置于中等濃度的變性劑緩沖液中，最后置于低濃度變性劑緩沖液中。其與一步透析的區(qū)別在于每個(gè)變性劑濃度平衡的建立。然而，如果錯(cuò)誤折疊或聚集率(kmis/agg)高于復(fù)性速率（kref）。那么這種方法將不起作用。

2.2 遞減變性劑濃度透析

為變性劑濃度遞減的一步透析法[5]。在高濃度變性劑中的變性蛋白裝入透析袋后置于變性劑溶液中，將透析液逐漸抽出，同時(shí)逐漸抽入復(fù)性緩沖液，透析過(guò)程中溶劑的泵出速率和復(fù)性液的泵入速率決定了變性劑濃度梯度減少。如果速度太快，它將類似于一步透析法，如果速度緩慢，它又類似于多步透析法。

2.3 凝膠過(guò)濾交換法

凝膠過(guò)濾柱在復(fù)性緩沖液中平衡。在變性液中的展開(kāi)的蛋白質(zhì)上柱，用復(fù)性緩沖液進(jìn)行洗脫。使用脫鹽柱將使蛋白質(zhì)與變性劑分離，而使用按蛋白質(zhì)大小分離柱將分離得到不同片段大小的蛋白質(zhì)。在一次透析復(fù)性過(guò)程中，變性劑濃度逐漸遞減，同樣，在凝膠過(guò)濾法中變性劑濃度也逐漸減少。如果展開(kāi)結(jié)構(gòu)或中間折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為天然結(jié)構(gòu)的速率慢于轉(zhuǎn)換為錯(cuò)誤折疊或聚集體的速率，那么隨著變性劑濃度的逐漸降低錯(cuò)誤折疊構(gòu)象將沒(méi)有足夠的時(shí)間轉(zhuǎn)換為天然結(jié)構(gòu)。另外，長(zhǎng)時(shí)間暴露在中間變性濃度可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集或錯(cuò)誤折疊。與透析的區(qū)別在于在其蛋白在折疊過(guò)程中柱模型所處的環(huán)境不同。在能夠防止蛋白錯(cuò)誤折疊與聚集的中間變性劑濃度下的蛋白折疊過(guò)程中，凝膠柱可能通過(guò)氫鍵和疏水作用與蛋白相互作用。而且柱模型可以使蛋白分散，有效減少了蛋白聚集。該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于鹽酸胍溶解的人白介素-6(IL-6)的復(fù)性[6]。

2.4 稀釋

高變性劑濃度蛋白質(zhì)樣品加入到大量的復(fù)性緩沖液中。稀釋法沒(méi)有經(jīng)過(guò)中間變性劑濃度，因此展開(kāi)蛋白在稀釋過(guò)程中會(huì)迅速崩潰。所以，在稀釋復(fù)性過(guò)程中有幾個(gè)參數(shù)需要考慮。首先，在正常稀釋法中，將在變性劑中的展開(kāi)蛋白加入到復(fù)性液中時(shí)，蛋白質(zhì)濃度與變性劑濃度都在增加，例如將6M鹽酸胍溶解的蛋白質(zhì)溶液加入到復(fù)性緩沖液中稀釋6倍后，復(fù)性緩沖液鹽酸胍濃度從0M變?yōu)?M。如果沒(méi)有低濃度變性劑濃度的存在，稀釋至緩沖溶液后將迅速崩潰形成一些剛性結(jié)構(gòu)，而不再能進(jìn)行結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變以及不能轉(zhuǎn)換為天然結(jié)構(gòu)。因此，我們建議在最終應(yīng)該含有一定濃度的變性劑，濃度的大小主要取決于蛋白復(fù)性后的穩(wěn)定性。

2.5 反稀釋

反向稀釋是將復(fù)性緩沖液加入到含有一定濃度變性劑的展開(kāi)蛋白質(zhì)溶液中，該情況下無(wú)論是變性劑和蛋白的濃度，都同時(shí)降低。與稀釋法不同，在中間濃度變性劑中蛋白質(zhì)濃度較高。這樣的條件下會(huì)導(dǎo)致蛋白的聚集和沉淀。然而，如果在中間的變性劑濃度的條件下，中間結(jié)構(gòu)為可溶和復(fù)性需要緩慢的結(jié)構(gòu)重排，這個(gè)方法可能比較適用。

2.6 固相復(fù)性

在變性劑存在的情況下，變性蛋白首先與固體基質(zhì)（如鎳樹(shù)脂或離子交換樹(shù)脂）以非共價(jià)結(jié)合。然后變性劑濃度減少為初始復(fù)性液濃度。由于蛋白質(zhì)分子與樹(shù)脂結(jié)合，該過(guò)程中減少了展開(kāi)蛋白的聚集和折疊中間體的形成。

2.7 小分子物質(zhì)助溶

小分子物質(zhì)（溶質(zhì)）通常被添加到復(fù)性溶劑中，以協(xié)助蛋白折疊。在一般情況下，特別是通過(guò)稀釋復(fù)性，復(fù)性溶劑中均含有低濃度的尿素或鹽酸胍。這個(gè)濃度是足夠低，以能保持高效復(fù)性，但高到足以維持折疊中間體的溶解度和靈活性。然而，僅有尿素或鹽酸胍是不夠的，共同的溶質(zhì)往往是必不可少的。沒(méi)有該小分子的存在，復(fù)性會(huì)產(chǎn)生不同程度的聚合或錯(cuò)誤折疊。這種小分子物質(zhì)可分為兩種，一種為增強(qiáng)折疊，另一種為抑制聚集。

折疊和聚集這兩種作用可能具有相互的排斥性，因?yàn)檎郫B的增強(qiáng)原則上增強(qiáng)了蛋白質(zhì)之間的相互作用，而聚集的抑制則降低了蛋白之間的的相互作用。聚集的抑制減少了折疊中間體的結(jié)合而不影響復(fù)性過(guò)程的進(jìn)行。它包括聚乙二醇[6]，環(huán)糊精[7]，精氨酸鹽酸[8，9]，脯氨酸[10-11]。與聚乙二醇和環(huán)糊精結(jié)合的折疊中間體為疏水區(qū)域。在這些小分子物質(zhì)中，精氨酸鹽酸是最常用的。然而，目前尚不清楚，精氨酸鹽酸如何降低折疊中間體的聚集。但它對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響已經(jīng)很明確，精氨酸鹽酸是一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定，也不折疊增強(qiáng)。精氨酸鹽酸既不是一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，也不增強(qiáng)蛋白的折疊。有許多極性小分子添加劑，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[12-13]，并能在體內(nèi)增強(qiáng)蛋白質(zhì)的折疊[14]。這些包括糖，多元醇，某些鹽類，如硫酸銨和氯化鎂，和某些氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸。雖然這將提高蛋白質(zhì)折疊成一個(gè)緊湊的結(jié)構(gòu)，他們也可增強(qiáng)錯(cuò)誤折疊和聚合。這些倒塌的結(jié)構(gòu)可能是過(guò)于緊湊和剛性，無(wú)法使錯(cuò)誤折疊的結(jié)構(gòu)重新折疊為天然結(jié)構(gòu)。