血栓動物模型的制備方法

王洋綜述，吳偉春審校

血栓是心血管系統內血液成分形成的固體質塊。血栓形成是一個復雜的過程，主要由于凝血功能紊亂所導致。在正常生理狀態下，血液中的凝血系統和抗凝血系統相互拮抗，保持動態平衡，當這種平衡被打破時即可形成血栓[1]。血栓動物模型的制備是根據血栓形成所需的條件和原理來進行的。模型制備的首要考慮因素是實驗動物的選擇，常用動物包括羊、豬、犬、兔子、大鼠以及小鼠等，其中血栓動物模型最常使用的是大鼠和小鼠。其次就是實驗部位的選擇：對于血管內血栓模型而言，實驗室多選用頸動脈、股動脈、腹主動脈、尾動脈、股靜脈、下腔靜脈及大腦中動脈等；對于心腔內血栓而言，左心室血栓較為常見。

1 血管內血栓動物模型的制備

血管內血栓動物模型主要包括動脈血栓和靜脈血栓[2]，其制備方法大致可以分為物理損傷法和化學損傷法兩種類型。

1.1 物理損傷法

物理損傷法是指通過一些損傷性方法破壞血管內膜，使內皮下膠原纖維暴露，從而激活血小板且釋放多種生物活性物質，最終啟動內源性和外源性凝血途徑導致血栓形成。下面就將常見的幾種模型制備方法作一簡單介紹。

機械損傷法：在靜脈血管及動脈血管中均適用。用刮匙、銀針等器械損傷血管內膜，暴露內皮下基質，然后血小板活化，出現血小板聚集及釋放等反應，最終形成血小板血栓。此方法應該注意的是血管內膜的破壞要達到一定深度，通常數毫米不等。

異物法：在靜脈血管及動脈血管中均適用。在血管腔內放置聚乙烯管、絲線或者鋼絲圈等異物，這些異物不僅可以損傷血管內膜激活凝血途徑，還可以改變血流狀態，使血流紊亂，利于血栓形成，但是形成的血栓大部分是在異物上附著形成。有學者描述了大鼠動脈-靜脈旁路血栓形成模型[3]，首先分離出大鼠的左側頸動脈及右側頸靜脈，在兩側血管之間連接長約7.5 cm 的導管形成旁路，導管內含有絲線，血液循環一段時間后絲線上可以形成血栓。

結扎法：在靜脈血管及動脈血管中均適用。根據不同的動物類型及實驗目的，選擇結扎的血管也各不相同，常被選擇結扎的靜脈血管包括下腔靜脈、髂靜脈和股靜脈等。結扎法操作簡單、重復性好，方法是使用絲線結扎目標血管或者使用鑷子或銀針等鉗夾目標血管數小時，目的是使局部血流淤滯、阻斷，導致內皮細胞損傷從而啟動內源性凝血途徑導致血栓形成。有學者在大鼠或小鼠麻醉后經腹中線解剖，鈍性分離下腔靜脈，然后用不可吸收7-0聚乙烯縫合線結扎下腔靜脈而形成血栓[4]。

電流損傷法：在靜脈血管及動脈血管中均適用。Diaz 等[5]將鍍銀的銅線連接到一根25 號針上，將其插入皮下組織和下腔靜脈遠心端，然后施加250 μA 的直流電約15 min 即可通過促進氧自由基形成而造成內皮細胞損傷。

低溫加壓損傷法：主要利用低溫及加壓狀態下血流速度減慢的原理，同時血管內膜也可發生損傷，最終使血栓形成。這種方法操作簡單，容易形成血栓。

1.2 化學損傷法

化學損傷法是指使用一些特殊化學試劑（三氯化鐵、角叉菜膠、月桂酸鈉、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶、過氧化氫等）后使內膜受損而形成血栓，不同化學物質作用最后形成的血栓成分也稍有差異。其中最常用的是三氯化鐵血栓形成法，此方法操作簡單、重復性好，最終形成的血栓結構接近于人類自發形成的血栓結構，對進一步的溶栓等研究有著顯著的意義。Huttinger 等[6]用此方法制備了頸動脈的血栓模型，首先將膠帶切成5.5 cm 的長度，將其浸泡在50%的氯化鐵溶液中一周備用，然后手術分離出犬的頸動脈、用紗布擦干動脈暴露區域，最后將浸泡了一周的膠帶纏繞在暴露的頸動脈周圍以形成血栓。研究表明不同濃度的三氯化鐵溶液導致血栓形成的時間不同。有文獻報道在一定濃度范圍內，三氯化鐵的濃度越高，最后血栓形成的時間會越短；除此之外，不同外敷時間窗最后形成的血栓大小也不盡相同，所以可以據規律制造不同規格大小的血栓（占據血管腔不同的比例）以滿足不同研究目的的需要[7-10]。截止到目前為止，通過含有三氯化鐵溶液的濾紙外敷血管使血栓形成的機制仍不完全清楚，可能是三氯化鐵用于血管表面后參與了活性氧生成，然后觸發血管壁損傷和內皮剝脫。也有學者聯合使用三氯化鐵溶液及凝血酶誘導腦血管內血栓形成[11]，這種方法更貼近于疾病的發病機制及病理生理學改變。

除此之外，光化學法也屬于化學損傷法范疇。該方法是在冷光源照射下通過改變血流狀態從而形成血栓，最大的優點是避免了對血管的機械損傷、能夠快速形成血栓，并且形成血栓的原理也更接近于臨床上血栓的發生機制，常用于腦血管疾病的模型制備；也有學者在血管內注射光敏感物質的基礎上使用特殊光線照射，通過破壞內皮細胞而形成血栓。Eitzman 等[12]介紹了通過光化學法形成頸內靜脈血栓的方法。具體步驟是將小鼠麻醉后仰臥于顯微鏡下，解剖游離出頸內靜脈，然后通過尾靜脈注射磷酸鹽緩沖液稀釋的色素玫瑰紅（RB）試劑，在注射之前用1.5 mW 的綠色激光（540 nm）照射游離出來的頸內靜脈區域，直至形成血栓。玫瑰紅試劑可以積聚于內皮細胞的脂質雙分子層中，在光照射下會發生光化學反應，導致氧自由基形成從而對內皮造成損害，但是需要注意的是，色素玫瑰紅試劑對動物可能有毒性作用。

2 心腔內血栓動物模型的制備

既往人們常常關注于血管內血栓模型的建立，鮮少關注心腔內血栓模型，就心腔內血栓動物模型而言，目前國內尚未見相關文獻報道，而國外有少數學者已經提出心腔內血栓模型的制備方法，總結這些模型也是緊緊圍繞血栓形成的三個條件制備的，即心血管內皮細胞的損傷、血流狀態的改變以及血液凝固性增高。

2.1 心血管內皮細胞損傷

血管內皮細胞損傷以后通過釋放多種凝血因子最終啟動內源性和外源性凝血途徑[13]，是血栓形成最重要和最常見的原因，也是唯一能單獨引起血栓形成的因素。眾所周知射頻消融所產生的高熱量可使內皮細胞損傷，故通過射頻消融也可制造心室、心房血栓[14]。具體方法是將電極導管經靜脈或動脈血管送入心腔的特定部位，然后通過釋放射頻電流導致心內膜損傷。損失部位可激活凝血途徑導致血栓形成。有研究表明射頻消融所致的病變面積越大，血栓的發生率就越高。而且病灶面積、深度、體積與血栓體積呈顯著正相關。但是據報道這種方法所致的血栓大小不易控制，而且容易出現栓塞事件。

2.2 血流狀態的改變

血流狀態的改變主要是由于血流緩慢或者渦流狀態、短暫性的血液停滯、血管受壓或者血液本身的黏性較大等原因，這也是靜脈血栓比動脈血栓發生率高的原因。低流量心臟狀態與心內血栓形成息息相關，而心臟驟停被認為是最終的低血流狀態。所以已有學者進行了這方面的探索[15]，方法是利用豬心臟驟停模型形成左心室血栓。首先進行心室顫動誘導，一旦血流停止，6 min 內即可出現血栓，成功率較高，但是研究表明這種方法形成的急性血栓在早期除顫或胸外按壓幾分鐘后就會溶解，并不穩定。另外，這種方法是由于心肌功能障礙導致血液淤滯而形成血栓的，所以一旦功能恢復就可能導致栓塞。

而目前文獻報道較為常見的心腔內血栓模型制備方法是在心肌梗死的模型基礎上注入止血劑，然后制備心腔內血栓或者附壁血栓。例如Hamilton等[16]提出的左心室血栓的制備方法，實驗動物是20～30 kg 的犬，在動物麻醉并開胸后，首先結扎心尖冠狀動脈使心尖心肌梗死，再通過注射纖維蛋白黏合劑核心，使其周圍形成新鮮血栓從而制造左心室的附壁血栓模型。這個實驗中涉及的纖維蛋白核心即Hemaseel 纖維蛋白黏合劑，是一種由重構的密封蛋白濃縮物和重構的凝血酶制成的止血劑。此方法操作稍微復雜，不僅需要先制作心肌梗死模型，而且注入左心室的纖維蛋白核心也需要實驗室多步驟制備，并且最后形成的血栓由于纖維蛋白核心的影響與臨床上常見的新鮮血栓亦有明顯區別。除此之外也有學者在冠狀動脈心尖段結扎制造心肌梗死模型后，在心內膜處注射5%苯甲酸鈉和1 000 單位的凝血酶，最后形成左心室附壁血栓[17]。

2.3 血液凝固性增加

血液凝固性增加主要是指遺傳性或者獲得性原因所導致的血液高凝狀態。有學者利用粒細胞集落刺激因子（G-CSF）誘導血液高凝狀態[18]，通過炎癥-血栓相互作用使小鼠左心室血栓形成。此方法在腹腔注射G-CSF 大約4 周以后可以觀察到左心室血栓形成，模型建立時間較長。

血栓動物模型的成功制備對臨床和科研工作有著諸多顯著的意義。最常見的是對溶栓藥物的評估，還可以對血栓相關疾病進行研究[19-20]。血管內血栓動物模型的制備方法多種多樣，在實際應用時應該根據研究的目的和需要選擇最為合適的模型制備方法。心腔內血栓的準確診斷在臨床上非常重要，常規經胸超聲心動圖由于聲窗等因素的影響對某些特殊部位的血栓難以顯示或者難以與心臟腫瘤、贅生物等鑒別，必要時需進行經食道超聲心動圖檢查，但是經食道超聲心動圖檢查會造成大部分患者感到不適。現在有一種比較新型的方法可以簡便地探查到心腔內的血栓，這就是使用血栓靶向超聲造影劑。這種特殊的造影劑能夠與血栓緊密結合，使血栓更容易顯示和鑒別。總之，心腔內血栓模型的制備有著重要的意義，為臨床和科學研究中有關血栓性疾病的研究提供了重要的基礎。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突