肺炎支原體P1蛋白的研究進展

彭凱嵐，曾焱華

肺炎支原體作為社區獲得性肺炎的常見病原體之一，對它的認識在臨床工作中有重大意義。肺炎支原體的致病機制主要是通過黏附呼吸道上皮細胞從而破壞黏膜上皮，引起炎癥反應[1]；而失去黏附能力的肺炎支原體菌株成為無毒株，因此，人們將黏附細胞器作為重點進行研究。其中P1蛋白作為主要黏附蛋白，不僅在黏附過程中發揮重要作用，同時也參與肺炎支原體的滑行運動，使其能夠從支氣管纖毛尖端轉移到宿主細胞表面；此外，P1蛋白含有多個抗原決定簇，具有很強的免疫原性，其相應的抗體可在感染患者的血清中檢測到，為肺炎支原體感染的血清學診斷和疫苗研制提供了新思路。本文對P1蛋白的基因結構與分型、功能及其在血清學診斷與疫苗制備方面的應用進行綜述。

1 P1蛋白的基因結構與分型

1.1P1蛋白的基因結構 肺炎支原體基因組全長816 bp，構成其黏附細胞器的主要蛋白P1基因(MPN141)含4 884 bp，GC含量為53.5%，P1蛋白的分子量為170 kDa，是肺炎支原體最大的黏附蛋白，直接與宿主細胞膜相互作用，其基因序列中包含21個編碼色氨酸的UGA密碼子，但UGA在大腸桿菌表達系統中編碼終止密碼子，因此，全長P1重組蛋白的表達一直未曾有進展，研究者多用片段表達進行相關實驗。P1基因位于P1操縱子內，該操縱子中還包含兩個開放閱讀框(ORF)：ORF4和ORF6。ORF6經共翻譯修飾編碼蛋白B(P90)和蛋白C(P40)，在上述蛋白的協助下P1蛋白與細胞骨架蛋白相互作用并聚集于黏附細胞器頂端。肺炎支原體基因組中共有RepMP1、RepMP2/3、RepMP4和RepMP5 4種重復序列。而P1操縱子中含有其中3種，即：位于P1基因3′端的RepMP2/3和5′端的RepMP4，以及ORF6內的RepMP5[2]。事實上，所有RepMP都有1個拷貝存在于該操縱子內或鄰近該操縱子，這表明所有的RepMP元件都可能是這段基因的殘基。同時，在肺炎支原體中，通過滑動錯配引起序列變異性的短串聯重復序列僅在P1基因中出現[3]。上述基因結構使得P1基因序列具有多態性，是P1蛋白抗原變異的基礎。

1.2P1蛋白的基因分型 P1蛋白基因是肺炎支原體臨床分離菌株分型的重要標志[4]。在P1蛋白的概念被提出后，研究者用Southern blot和PCR-RFLP對其基因進行分析，并根據其RepMP2/3和RepMP4元件的特點將肺炎支原體分為兩型，即目前常用的P1-Ⅰ和P1-Ⅱ分型。流行病學調查發現肺炎支原體的型別每9～10年發生1次轉變[5]，目前我國P1-Ⅰ型的流行率更高[6]。關于不同基因型致病力的強弱一直有爭論，有學者認為P1-Ⅱ型的致病力比Ⅰ型強[7]，Maria等[8]通過蛋白質組學分析，證實Ⅱ型菌株比Ⅰ型菌株產生的毒素更多；而對兒科患者的臨床評估卻顯示感染Ⅰ型肺炎支原體患者發生重癥支原體肺炎和肺外并發癥的風險明顯高于Ⅱ型患者[9]。Li等[10]對兩例病程截然不同的肺炎支原體感染患者分離物進行測序，發現兩個分離物之間的主要差異存在于P1蛋白基因中，由此推測P1蛋白的突變有可能改變肺炎支原體的致病性。

在隨后的臨床樣本分子分型中，更多的肺炎支原體亞型開始出現在人們的視野中[11]，Dorigo等[12]通過RFLP分析將P1-Ⅰ型分為1a～1e 5個亞型，P1-Ⅱ型分為2a～2c 3個亞型。有研究者對大量樣本進行測序和比對發現，肺炎支原體亞型的產生是由于MPN141內的RepMP2/3和RepMP4元件與基因組其他部位的RepMP2/3和RepMP4發生同源DNA重組引起的，且RepMP4可能比RepMP2/3更具遺傳多態性。后續的實驗則進一步證實了肺炎支原體基因組中的任意兩個RepMP元件之間都可以發生同源DNA重組，甚至可以發生2次重組，對肺炎支原體內所有的RepMP元件進行編號分析發現，在分離的菌株R1108/01和R0109/01中發現RepMP4-c的一部分被來自RepMP4-g的序列替換，導致P1蛋白中的15個氨基酸發生了替換，RepMP2/3-d的一部分被來自RepMP2/3-a的序列替換引起29個氨基酸的修飾[13]。Qiu等[14]對中國1起支原體肺炎暴發性流行中的菌株的RepMP2/3和RepMP4元件進行檢測，在P1-Ⅰ型的RepMP2/3元件中發現一段新的核苷酸片段，共有28個突變，引起24個氨基酸替換；在P1-Ⅱ型的RepMP4元件中發現31個突變。這些同源重組和突變可能是肺炎支原體出現耐藥性和免疫逃逸的主要原因[15-16]。

2 P1蛋白的功能

P1蛋白不含半胱氨酸，因此無法形成分子內二硫鍵，為其多肽鏈帶來了相當好的靈活性，而其羧基末端的脯氨酸含量較高，對細胞黏附素的拓撲結構起到調節作用。P1蛋白包括3個結構域，分別為保守的結構域Ⅰ，以及跨膜片段連接的結構域Ⅱ和Ⅲ[17]。然而，由于P1蛋白是1個由1 627個氨基酸殘基組成的大蛋白，并且在C末端有1個跨膜片段，目前還沒有關于重組全長P1蛋白的研究，這是探索P1蛋白詳細結構的主要障礙。Kenri等[18]首次分離了具有均勻折疊結構的重組P1蛋白，具有正確折疊的蛋白有助于我們闡明P1蛋白的詳細結構和功能。

2.1P1蛋白與細胞黏附 P1蛋白的主要功能是參與肺炎支原體對宿主細胞的黏附，在P1蛋白的介導下成功寄生于呼吸道黏膜的肺炎支原體并不侵入細胞，而是黏附并隱藏在細胞間隱窩內，逃避纖毛運動的清除作用和巨噬細胞的吞噬，釋放毒力因子，損傷宿主細胞。而失去黏附功能的P1蛋白缺失株則成為無毒株[19]。事實上，P1蛋白無法單獨完成對細胞的黏附，同時參與黏附的蛋白還包括P30、P116，以及蛋白質A、B、C。散在分布于胞膜的P1前體蛋白在肺炎支原體與靶細胞接觸后，酶切水解為成熟的P1，兩分子P1和兩分子蛋白B形成P1黏附素復合體并與細胞骨架蛋白相互作用，在HWM1～3的協助下，聚集于黏附細胞器頂端[20]。蛋白B和蛋白C丟失將直接導致黏附細胞器的缺失。P1蛋白的正確定位依賴HMW1的作用，HMW1-2缺失時，P1蛋白無法定位至細胞骨架結構，無法到達肺炎支原體表面；當輔助蛋白均缺失時，P1蛋白不集中在肺炎支原體細胞頂端，而是均勻分布在細胞膜上[21]。而J-結構域蛋白(TopJ)也在黏附細胞器的形成過程中發揮重要作用，通過激活分子伴侶蛋白DnaK的ATP酶，催化黏附細胞器的蛋白結合及其正確折疊，TopJ突變肺炎支原體表現為黏附細胞器中P1、P30、P41的聚集減少[22]。P1和P30可直接參與受體結合，P30基因突變的肺炎支原體菌株中，黏附蛋白復合體中P1蛋白的密度也降低[23]。此外，肺炎支原體在非生物表面的黏附和生物被膜的形成都與P1蛋白有關，抗P1抗體可抑制生物被膜的形成[24]。Widjaja等[25]將菌體內的P1蛋白進行分離，發現P1蛋白可被切割加工為22種蛋白形式，且每種蛋白形式都可分別與不同的宿主分子或其結構模擬物相結合，如人類肺癌細胞A549表面蛋白復合物、肌動蛋白、纖連蛋白等，推測經過加工的P1蛋白可能在細胞中發揮多種作用，甚至可釋放至細胞外環境中，通過免疫誘導機制保障肺炎支原體的定植。

2.2P1蛋白與炎癥反應 P1蛋白的強免疫原性，可刺激宿主免疫系統對其進行免疫應答。Heok等[26]發現，黏附型肺炎支原體可誘導鼠嗜堿性粒細胞中IL-4的產生，非黏附型肺炎支原體則無法有效誘導細胞因子反應，而上述兩者的主要差別在于黏附型肺炎支原體富含P1蛋白，說明P1蛋白在IL-4的合成與釋放過程中起關鍵作用，而神經氨酸酶可消除肺炎支原體對IL-4的誘導作用，P1蛋白可能通過直接與唾液酸殘基接觸誘導炎癥反應。將肺炎支原體感染患者的血細胞與經P1蛋白刺激的健康獻血者外周單個核細胞進行對比分析，發現P1蛋白可激活Th細胞，使巨噬細胞增殖，促使Th0細胞向Th2細胞分化，分泌IL-4和IL-5，引起免疫功能和細胞因子分泌紊亂，誘導B細胞抗體類別向IgE轉變，從而引起強烈的哮喘[27]。此外，P1蛋白與哺乳動物的細胞骨架角蛋白和纖維蛋白原α鏈前體都有著廣泛的同源性，可能與肺炎支原體感染后出現的自身免疫性病理生理機制有關，通過引起自身免疫應答，造成肺外組織病變[28]。盡管多種研究表明肺炎支原體參與細胞黏附的蛋白(P1、P40、P90)是其致病的重要因素，但細胞黏附具體的致炎機制尚未明確[29]。

2.3P1蛋白在滑行中的作用 肺炎支原體的滑行運動可使其向宿主細胞表面受體靠近，促進病原體的進一步擴散。電子冷凍斷層掃描證實P1蛋白也參與肺炎支原體的滑行運動，抗P1單克隆抗體可以濃度依賴的方式降低已黏附的肺炎支原體的滑行速度[30]。Williams等[31]發現P1蛋白可與α-2,3、α-2,6兩種唾液酸乳糖結合，但僅在與α-2,3唾液酸乳糖結合時可發生滑行。肺炎支原體的滑行機制與目前已知的滑行機制皆不相同，其滑行也由黏附細胞器介導，其中的厚板延展或壓縮可引起整個黏附細胞器的伸長或縮短，P1黏附素復合物作為其表面結構則反復地與宿主細胞表面受體(即唾液酸寡糖)結合和分離，細胞器前端的P1蛋白先發生分離，在細胞器伸長后又優先結合，從而使病原體不斷向前運動[17]。多位學者已對肺炎支原體的滑行機制提出了有依據的猜想[32]，但是，需要更多的信息來闡明這種獨特的機制，包括其中涉及的蛋白質和復合物的結構與功能及其動力系統。

3 P1蛋白在血清學診斷中的應用

肺炎支原體感染與流感癥狀相似，無特異性臨床表現。因此，對臨床醫生來說，早期和準確的診斷是必要的，以便開出正確的抗生素治療處方。目前常用的肺炎支原體診斷方案，細菌培養耗時長、敏感性低、特異性差。盡管診斷手段多樣，但針對肺炎支原體的診斷還有待進一步研究。

P1蛋白是在人和實驗動物中能誘導強體液免疫反應的主要黏附蛋白，是作為血清學診斷抗原的潛在候選物。然而，全長P1蛋白與其他支原體蛋白之間存在共同的抗原決定簇。因此，研究者們試圖篩選出其中肺炎支原體特異性的抗原表位，并將其與其他抗原表位聯合使用。

3.1P1蛋白特異片段篩選 近年來，生物信息學在分子生物學領域廣泛應用，有學者利用生物信息學對P1蛋白的抗原表位進行預測并將其進行表達純化，結果表明兩個位于P1蛋白C端的重組蛋白皆可被肺炎支原體感染患者的血清樣品識別，且抗重組蛋白血清和其他呼吸道抗原之間沒有交叉反應[33]。Chourasia等[34]在大腸桿菌內分別表達了P1蛋白的N端和C端，并將純化的蛋白與目前通用的ELISA試劑盒進行比較，發現P1-C1具有很強的免疫反應性。有學者利用密碼子優化，將P1基因分為4段分別表達，發現P1蛋白的免疫優勢區分布在P1蛋白的全長上，而黏附區位于N端和C端。Beghetto等[35]構建了肺炎支原體的全基因組文庫，通過噬菌體展示技術篩選到4個新的免疫原性多肽；在該實驗中，大多數感染者血清都可與P1蛋白的1個片段發生陽性反應，該片段對應P1蛋白中的第1 159-1 521位殘基，這一發現不僅與Chourasia等人的實驗相符，同時也提示了噬菌體展示系統在抗原篩選中的應用價值。在本課題組以前的研究[36]中，我們表達純化了P1蛋白的1 160-1 498位氨基酸并制備了其相應的多克隆抗體，對噬菌體展示隨機12肽庫進行生物淘選，發現多肽HLQMRLTKLRMP可與多克隆抗體特異性結合，且與肺炎支原體P1蛋白的1 266-1 272位氨基酸(QVRTKLR)有75%的同源性，表明該多肽可能為P1蛋白的優勢模擬表位，與患者血清進行ELISA試驗發現其敏感性和特異性都很好，可用于肺炎支原體感染的血清學診斷。

3.2P1蛋白與其他蛋白片段的聯合使用 Montagnani等[37]對肺炎支原體抗原的免疫優勢B細胞表位進行篩選，并通過基因工程分別表達了P1、P30和MPN456的片段，以及上述3段蛋白的融合蛋白EC-12，分別與確診病例、疑似病例以及鏈球菌感染患者的血清進行ELISA實驗，與商業試劑盒比較發現，重組蛋白的敏感性高于傳統全菌抗原，尤其以融合蛋白EC-12的敏感性最高，且重組抗原能有效地鑒別肺炎支原體感染者和非感染者。Hélène等[38]評估了肺炎支原體ATP合成酶β亞基(AtpD)和P1蛋白C末端(P1-C)片段融合抗原的診斷性能，發現其與成人血清樣本IgM反應的陽性率達到80%，比商業試劑盒和上述兩種抗原單獨使用的陽性率都要高，曾有學者認為青少年在急性感染時有著較高水平的IgM抗體，而成年人則缺乏IgM，該實驗表明成年感染者血清中也存在IgM抗體，只是由于檢測抗原靈敏度較低而被忽視，而rAtpD-rP1-C抗原對IgM的高靈敏性有助于提高肺炎支原體感染的早期特異性診斷，值得注意的是，該抗原對IgA和IgG的靈敏度較差。

4 P1蛋白與疫苗制備

肺炎支原體感染可引起多種疾病，每年秋冬季多發，隨著耐藥菌株的出現，肺炎支原體的防治，尤其在疫苗研制方面，成為了醫療衛生行業關注的重點[39]。目前得到應用的肺炎支原體疫苗多用于動物，還沒有可供臨床使用的疫苗。P1蛋白抗原的特異性強，其中和抗體可阻止肺炎支原體對宿主細胞的黏附。在利用P1蛋白的強抗原性進行感染診斷的同時，研究者們也利用這一特性研制相關疫苗。

早期有學者發現，在肺炎支原體感染患者的血清中存在高滴度的P1特異性抗體，但這些患者卻不能避免二次感染，對患者血清的黏附抑制功能進行實驗，發現P1蛋白誘導的抗體大多不針對P1蛋白的細胞黏附位點。因此，大多數學者在對P1蛋白片段進行篩選后，將其與其他特異性抗原聯合使用，以期達到特異且高效的作用。Schurwanz等[40]將P1蛋白分為15段分別表達，與肺炎支原體感染的豚鼠血清和肺炎支原體陽性患者血清反應，發現第14段免疫原性最強，將該段蛋白與P30蛋白構建成為融合蛋白，免疫豚鼠，產生的抗體可顯著降低肺炎支原體對人肺支氣管上皮細胞的黏附能力。Hausner等[41]則用P1和P30蛋白的表面暴露及黏附相關區域構建了嵌合重組蛋白HP14/30，可在豚鼠呼吸道中誘導出穩定、持久、高水平的IgA，且該血清具有抑制黏附的作用。朱翠明等[42]在證實P1 蛋白C端1 125-1 395段重組蛋白可刺激小鼠產生特異性抗血清后，將P1蛋白C端分別與IL-2和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)融合制成核酸疫苗，發現與單獨的P1蛋白C端相比，上述兩種核酸疫苗可有效誘導免疫應答，但P1C-IL-2疫苗會引起較強的肺組織炎癥。Chen等[43]將P116N、P1C和P30 3種黏附蛋白片段制成嵌合蛋白(MP559)，并用其免疫兔，發現用MP559免疫的兔可產生針對P116N、P1C和P30的抗體，且MP559能與P116N、P1C和P30免疫的兔血清發生反應，這種融合蛋白有望取代上述3種抗原成為候選疫苗分子。

5 總結與展望

肺炎支原體是引起呼吸道感染的重要病原菌，其致病過程為：黏附、增殖、釋放毒力因子；其中黏附過程為肺炎支原體感染的重要環節，針對其主要黏附蛋白P1做出的一系列研究，可了解肺炎支原體的致病機制，從而對其進行診斷、治療與防治。P1蛋白不僅參與病原體的黏附過程，其在滑行與炎癥反應中也發揮重要作用，主流的研究方向認為P1蛋白主要定位于肺炎支原體黏附細胞器表面，但有研究發現肺炎支原體感染患者的抗體常結合于與黏附無關的P1蛋白片段[40]，因此，有學者提出P1蛋白可能在經過切割與加工后釋放至細胞外環境中，中和抗體，發揮免疫誘餌機制[25]，為P1蛋白在宿主體內發揮的作用提供了無限猜想。本文討論了肺炎支原體P1蛋白在結構、功能、診斷和預防方面的研究進展，盡管目前對P1蛋白的基因結構、氨基酸構成已有所了解，但P1基因型的變異性與肺炎支原體耐藥及免疫逃逸之間的關系、P1蛋白的完整結構、P1蛋白與黏附蛋白間的相互作用、P1蛋白與宿主細胞表面受體的相互作用、P1蛋白在炎癥反應中的作用及其在疫苗中的應用還有待進一步探明。

利益沖突：無