1株粘質沙雷氏菌噬菌體的分離和鑒定

肖小平，陳依玲，張仁利

粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)是一種腐生菌，在水和土壤中常見，也經常污染動、植物性食品[1]。粘質沙雷氏菌是一種臨床上常見的機會病原菌[2]，醫護人員被污染的手被認為是其主要的傳播媒介[3-5]。在機體免疫力低下的時候可以引起肺部感染、敗血癥等疾病[1,6-9]。由于臨床上抗生素的濫用和不合理使用，粘質沙雷氏菌對多種抗生素具有耐藥，給感染控制和治療帶來挑戰[10-11]。除此之外，很多媒介昆蟲的幼蟲階段生活在水中，粘質沙雷氏菌在這些昆蟲的腸道中也大量存在，促進疾病傳播[6,12-14]。噬菌體(Phage)是細菌內寄生生物，在自然界也是分布廣泛。噬菌體侵染細菌后可以快速增殖并裂解宿主菌[15]，目前臨床上也有用噬菌體用于治療的嘗試[16]。因此分離針對粘質沙雷氏菌的噬菌體對防治粘質沙雷氏菌感染具有潛在的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1主要試劑和儀器 LB營養肉湯(028324，廣東環凱微生物科技有限公司)、瓊脂(028990，廣東環凱微生物科技有限公司)、上層LB培養基(20 g LB營養肉湯加7 g瓊脂溶于1L蒸餾水)、下層LB培養基(20 g LB營養肉湯加15 g瓊脂溶于1 L蒸餾水)、全溫振蕩培養箱(Shel lab)、II級A2型生物安全柜(Telstar Bio-II-A)、低溫離心機(Eppendorf centrifage 5417R)、單孔水浴鍋(JuLBO ED-27)。

1.1.2實驗用菌種 粘質沙雷氏菌(Sm01、Baz01、CICC22004、CGMCC1.2818、BNCC107931)、大腸桿菌(TH12641)、金黃色葡萄球菌(780)、綠膿桿菌(Pseudomonassp. SQ-7)均為實驗室保存。

1.2噬菌體的分離和培養 取深圳某河邊污水，4 000 r/min離心15 min，用0.22 μm的濾膜過濾除菌，將濾液裝入無菌培養瓶。取4 mL過濾后的上清，加入200 μL的對數期宿主菌培養液，放置37 ℃，220 r/min培養箱培養3 h，用微孔濾膜過濾得到噬菌體原液。

1.3噬菌體原液單層平板驗證實驗 準備兩塊1.5% LB瓊脂平板，取宿主菌培養物100 μL滴至平板正中央， 用無菌的涂布棒將菌液均勻地涂開；待其晾干后，取上述噬菌體原液100 μL滴于其中一塊板，用無菌的涂布棒將液體均勻地涂開；待自然晾干后，置于37 ℃培養箱培養10 h。

1.4噬菌體雙層平板噬菌斑實驗 將噬菌體原液10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍比稀釋，取相應的幾個梯度的噬菌體稀釋液各0.1 mL與宿主菌液0.2 mL充分混勻，鋪雙層瓊脂平板， 37 ℃恒溫培養10 h左右，對每個瓊脂平皿進行噬菌斑計數。根據稀釋的倍數計算得到的噬菌體初始濃度即得噬菌體效價。在雙層瓊脂平板上挑取噬菌斑形狀大小一致，單個獨立的噬菌斑，用無菌的接種針穿刺選好的噬菌斑，接入3 mL LB 肉湯培養基，輕微攪拌幾次，加入0.2 mL 含有粘質沙雷氏菌菌液，搖勻之后在室溫靜置1 h，37 ℃培養12 h, 4 ℃下12 000×g 離心30 min, 用0.22 μm的濾膜過去除菌，上清液4 ℃保存， 獲得的單一噬菌體。

1.5噬菌譜實驗 選擇粘質沙雷氏菌的5個菌株和大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌進行實驗。準備1.5% LB瓊脂平板，每組2塊；取100 μL細菌和100 μL噬菌體混合，鋪雙層瓊脂平板，對照組加入等量的PBS，置于37 ℃培養箱培養10 h。

1.6蚊蟲腸道內裂解實驗 埃及伊蚊(洛克菲勒株)飼養于低溫照明培養箱，保持26 ℃～28 ℃恒溫、80%濕度，按照文獻標準方法進行飼養[17]。選取羽化5～7 d的雌性埃及伊蚊，首先給蚊蟲飼喂含有抗生素的10%蔗糖溶液(20 U青霉素、20 mg鏈霉素/mL)，連續飼喂3 d，每24 h更換。飼喂3 d后將含有抗生素的蔗糖溶液撤走，在溫度28 ℃，濕度80%的條件下讓其饑餓24 h。然后飼喂帶有粘質沙雷氏菌Sm01的蔗糖溶液。連續飼喂3 d。將上述蚊蟲分成兩組，其中一組只飼喂蔗糖溶液，另外一組飼喂添加了噬菌體SHENZHEN01(107PFU/mL)的蔗糖溶液。18 h后每組挑選4～5只蚊蟲進行實驗。先用75%的乙醇溶液清洗蚊蟲表面3次，無菌PBS清洗1次，接著在體視顯微鏡下解剖蚊蟲的中腸，放入裝有400 μL PBS的無菌的EP管中，用無菌的研磨棒進行研磨, 稀釋103～105倍涂板，37 ℃培養箱培養12 h。

2 結 果

2.1噬菌體平板驗證和單一性篩選實驗 在單層平板實驗中，涂有菌液的區域長出均勻的粘質沙雷氏菌，涂有加入噬菌體菌液的區域沒有菌落出現。由此判斷，該噬菌體能夠裂解粘質沙雷氏菌，而且噬菌體原液中含有滴度較高的烈性噬菌體(圖1A)。單一性噬菌體通過雙層平板實驗獲得，噬菌斑經過多次穿刺培養后，分離得到單一的噬菌體，該噬菌體邊緣清晰，噬斑直徑約1 mm (培養10 h)(圖1B)，我們將該噬菌體命名為SHENZHEN01，保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，編號為61140。

A：粘質沙雷氏菌噬菌體單層平板實驗；B: 噬菌體單一性篩選。圖1 噬菌體噬斑實驗Fig.1 Single layer plate plaque formation experiment

2.2噬菌體裂解譜實驗 進一步確認SHENZHEN01噬菌體的裂解譜。我們首先選擇粘質沙雷氏菌的5個菌株(Sm01、Baz01、CICC22004、CGMCC1.2818、BNCC107931)進行雙層平板實驗，將噬菌體原液按照1∶1 、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000進行稀釋，將噬菌體和粘質沙雷氏菌一起通過雙層瓊脂平板驗證。結果發現SHENZHEN01噬菌體對Sm01和Baz01有明顯的裂解能力，對其他3株粘質沙雷氏菌沒有裂解作用(圖2A)。另外，我們驗證了SHENZHEN01噬菌體對其他種類細菌的裂解能力，將噬菌體原液和粘質沙雷氏菌(S.marcescens) Sm01、大腸桿菌(E.coli)TH12641、金黃色葡萄球菌(S.aureus)780、綠膿桿菌(P.aeruginosa)SQ-7一起通過雙層瓊脂平板驗證。結果表明，SHENZHEN01噬菌體不能裂解大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌(圖2B)。這些結果表明噬菌體SHENZHEN01的裂解作用有菌株特異性。

2.3蚊蟲腸道內裂解實驗 蚊蟲經過消毒處理，取中腸研磨進行涂板計數。單獨飼喂抗生素的蚊子(Mock組)中腸涂在LB 固體平板上幾乎不長細菌，表明抗生素處理是成功的；飼喂了粘質沙雷氏菌Sm01的蚊子中腸涂板可見大量細菌生長，表明粘質沙雷氏菌Sm01可以在蚊子中腸成功定植(Serratia marcescens組)；而飼喂了噬菌體SHENZHEN01的蚊子中腸涂板幾乎沒有細菌生長(Serratia marcescens+phage組)，表明飼喂的噬菌體在蚊子體內也能裂解細菌(圖3A), 通過平板計數顯示飼喂了噬菌體的蚊子腸子中的粘質沙雷氏菌明顯減少(圖3B)，充分表明這個噬菌體在蚊蟲體內也是有活性的，可以在體內裂解宿主細菌。

A：5株粘質沙雷氏菌與不同稀釋度的噬菌體混合涂雙層瓊脂平板；B：四種細菌分別和噬菌體混合涂雙層瓊脂平板圖2 噬菌體裂解譜實驗Fig.2 Bacteriophage lysis spectrum

A: 蚊蟲腸道內噬菌體裂解能力；B: 蚊蟲飼喂噬菌體后腸道粘質沙雷氏菌計數。Mock組為飼喂含有抗生素的10%蔗糖溶液，3 d后，只飼喂蔗糖溶液；Serratia marcescens組飼喂含有抗生素的10%蔗糖溶液,3 d后，飼喂帶有粘質沙雷氏菌Sm01的蔗糖溶液，連續飼喂3 d；Serratia marcescens+phage組為飼喂含有抗生素的10%蔗糖溶液，3 d后，飼喂添加了噬菌體SHENZHEN01(107 PFU/mL)的蔗糖溶液。18 h后每組挑選4～5只蚊蟲進行實驗。圖3 噬菌體在蚊蟲腸道內裂解實驗Fig.3 Phage lysis in mosquitoes gut

3 討 論

粘質沙雷氏菌是臨床上一種重要的條件致病菌[2]，屬于革蘭氏陰性菌。在自然界，粘質沙雷氏菌在培養的時候呈現白色、粉紅、玫瑰紅3種顏色，我們采用的粘質沙雷氏菌來自于蚊蟲腸道[14]，呈現白色。粘質沙雷氏菌在臨床上可以引起腦膜炎、肺部感染等疾病[6-9]，耐藥性的出現使這種菌很容易發生院內感染，對人的健康產生巨大威脅[10-11]。噬菌體不會感染人，只感染特異的細菌，在水產養殖和耐藥菌感染治療方面具有光明的應用前景，越來越多的研究尋找特異性的噬菌體來解決細菌耐藥的治療問題[18]。我們利用埃及伊蚊來源的粘質沙雷氏菌為宿主，從污水中分離得到1株噬菌體SHENZHEN01，通過單層平板實驗就可以直接鑒定其裂解能力。由于噬菌體對細菌的裂解能力具有特異性和高效性。我們對噬菌體SHENZHEN01的裂解譜進行了分析，發現SHENZHEN01只對粘質沙雷氏菌Sm01和Baz01有效，對其他3株粘質沙雷氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌均無裂解作用。

粘質沙雷氏菌不僅可以定植到皮膚表面，也可以定植到腸道[2,14,19]。由于動物或者昆蟲體內環境與體外環境的差異，只有高效而且能夠耐受體內環境的噬菌體才有可能走向應用，目前已經報道的痢疾噬菌體可以在體內應用于相關疾病的治療[20]。在這里，我們初步研究了噬菌體SHENZHEN01在蚊蟲腸道內的裂解效果，結果表明該噬菌體在蚊蟲腸道里仍然能夠發揮裂解作用，這些研究為后續SHENZHEN01的應用提供重要的基礎。

噬菌體由于其感染的特異性，在水產養殖、耐藥菌感染、院內特殊病房如燒傷感染等方面具有極大應用價值。噬菌體用于治療也有本身的缺點，如噬菌譜窄、產生細菌耐藥性、給藥方式沒有統一標準等[21]。尋找更多的噬菌體，應用噬菌體雞尾酒療法是一個有效的辦法[22]。噬菌體在自然界具有多樣性，種類繁多，國家層面也需要加大對噬菌體治療的基礎研究投入，建成全國性甚至世界性的噬菌體庫，資源共享，噬菌體治療的價值才能顯現出來。

利益沖突：無