布魯氏菌微滴式數字PCR方法的建立與應用

田國忠，姜 海，薛盼盼，樸東日，趙鴻雁，楊曉雯，張京云

布魯氏菌病(Brucellosis)簡稱布病，是由細胞內寄生的布魯氏菌(Brucella)引起的一種人獸共患傳染-變態反應性疾病，可感染多種家畜、家禽和野生動物，其中與人類密切相關的動物主要有羊、牛、豬和犬等。病畜的血液、分泌物、排泄物、流產物及乳類含有的致病菌，可在動物間傳播，造成感染發病；傳染到人，可引起人體感染，出現臨床癥狀。目前布魯氏菌的檢測方法主要有：細菌的分離培養、布魯氏菌抗體檢測(試管凝集試驗)和分子生物學檢測(常規PCR、熒光定量PCR和環介導等溫擴增技術)等。細菌的分離培養和血清學診斷技術是經典方法，但存在著檢測周期長、操作繁瑣、易漏檢和潛在生物危害等缺點。常規PCR方法需要凝膠電泳分析，容易發生PCR產物的實驗室污染，并且靈敏性低；熒光定量PCR具有較高的靈敏性，但是血液等標本中經常存在的PCR抑制因素影響了熒光定量PCR的實際應用[1-2]；環介導等溫擴增技術由于引物間的非特異性擴增而易產生假陽性結果。微滴式數字PCR方法(Droplet digital PCR，ddPCR)是近年來發展起來的快速、準確、可實現DNA絕對定量的PCR方法，已經廣泛應用于細菌和病毒的檢測[3]。本研究建立了布魯氏菌的ddPCR方法，可實現對布魯氏菌核酸DNA快速、準確的定量檢測，適合布病臨床標本和布病的分子流行病學調查。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 微滴式數字PCR系統QX200 Droplet Digital PCR(Bio-Rad，美國)包括微滴生成儀、微滴分析儀、封膜儀和Quanta Soft V1.7.4軟件。其它設備：熒光定量PCR儀(LightCycler 4800II，Roche，美國)，普通PCR擴增儀(LabcyclerK，SENAQUEST，德國)和DNA微量分光光度測定儀(spectrophotometer NanoDrop 1000，美國)。熒光定量PCR試劑Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(寶生物工程(大連)有限公司，中國)；ddPCR試劑和耗材，包括ddPCRTMSupermix for Probes、微滴生成油、微滴生成卡槽、微滴生成卡槽膠墊和錫紙膜，均由美國Bio-Rad公司生產；細菌基因組DNA提取試劑盒和血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2引物和探針 熒光定量PCR和ddPCR使用相同的引物和探針[4]，由生工(上海)生物科技有限公司合成。其序列為：上游引物B4 5′-GCTCGGTTGCCAATATCAATGC-3′，下游引物B5 5′-GGGTAAAGCGTCGCCAGAAG-3′，探針probe 5′FAM-AAATCTTCCACCTTGCCCTTGCCATCA-3′ BHQ1。

1.3菌株和標本 標準菌株S3(豬種布魯氏菌生物3型)用于ddPCR反應體系的優化和靈敏性評價。特異性評價使用了7株其它種屬的菌株，包括鉤端螺旋體、小腸結腸炎耶爾森菌(O∶9)、霍亂弧菌(非O1/非O139血清型)、大腸埃希菌(O∶157)、結核分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌和傷寒沙門菌各一株，其菌株核酸由中國疾病預防與控制中心傳染病預防控制所相關科室提供。采集于2014年3月一起羊種布魯氏菌病暴發疫情的17份工作人員血液標本核酸和5份羊血液標本核酸DNA用于ddPCR方法的實際檢測效果評價。該疫情的相關流行病學調查資料和樣本DNA的提取方法詳見文獻[5]。

1.4靈敏性評價 將經過連續3代培養的標準菌株S3的新鮮培養物，用0.85%的生理鹽水制成菌懸液，取200 μL菌懸液，10 000 r/min離心1 min，棄去上清，沉淀物按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取，洗脫體積為200 μL；應用DNA微量分光光度測定儀測定DNA濃度，并對DNA進行2倍的系列稀釋。對各個稀釋度的DNA分別進行ddPCR和熒光定量PCR檢測，每個稀釋度進行4次平行實驗，取4次檢測的平均值分析線性區間和靈敏性。

1.5特異性評價 將鉤端螺旋體、小腸結腸炎耶爾森菌(O∶9)、霍亂弧菌(非O1/非O139血清型)、大腸埃希菌(O∶157)、結核分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌和傷寒沙門菌的核酸DNA，分別稀釋到1 ng/μL、10 pg/μL和10 fg/μL 3個濃度，每個稀釋度進行4次重復檢測，以評價熒光定量PCR和ddPCR的特異性。

1.6熒光定量PCR反應條件 20 μL的反應體系包含：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) (2×) l0 μL，上、下游引物(10 mol/L)各0.8 μL ，探針(10 mol/L)0.4 μL，DNA模板量為1 μL，補充無菌去離子蒸餾水至20 μL體積。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環，在退火階段檢測熒光信號。

1.7ddPCR反應條件 20 μL反應體系包括：ddPCRTM預混液(Supermix for Probes)10 μL；核酸DNA模板1 μL；上、下游引物和探針(待優化)；補充無菌去離子蒸餾水至20 μL體積。隨后將20 μL反應液和70 μL微滴生成油加入到微滴生成卡槽內，蓋上膠墊，放入微滴生成儀中產生微滴。隨后將生成的微滴用移液器轉移到96孔PCR板中，蓋上錫紙膜，用封膜儀封口后，放在熱循環PCR儀中運行。ddPCR擴增條件為：95 ℃ 預變性10 min；95 ℃變性30 s，退火溫度(待優化)1 min，循環40次；最后98 ℃酶失活10 min。ddPCR擴增完成后，將96孔PCR板放在微滴分析儀中讀取熒光信號，通過QuantaSoftV1.7.4軟件對結果進行分析。

2 結 果

2.1ddPCR反應體系和擴增條件的優化 在20 μL反應體系中，固定引物(10 mol/L)加入量為1.6 μL，設置探針(10 mol/L)加入量分別為0.3 μL、0.5 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.2 μL、1.6 μL和1.8 μL。如圖1A所示，各探針濃度均能明確區分陽性微滴和陰性微滴。從減少“拖尾”現象和擴增效果的角度，選擇使用的探針濃度為0.4 mol/L(即加入0.8 μL探針)。在20 μL反應體系中，固定探針(10 mol/L)加入量0.8 μL，設置引物(10 mol/L)加入量分別為0.3 μL、0.5 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.2 μL、1.6 μL和1.8 μL，結果如圖1B所示。從減少“拖尾”現象和擴增效果的角度，選擇使用的引物濃度為0.8 mol/L(即加入引物1.6 μL)。在20 μL反應體系中，探針(0.8 μL)和引物(1.6 μL)加入量固定不變，設置退火溫度分別為55 ℃、56 ℃、57 ℃、59 ℃、60 ℃、61 ℃和62 ℃，如圖1C所示，各溫度均能明確區分陽性微滴和陰性微滴，從減少非特異擴增和擴增效果的角度，選用的退火溫度為60 ℃。

A：探針濃度優化：引物濃度固定為0.8 mol/L，各孔使用的探針濃度在圖上部標出。B：引物濃度優化：探針濃度固定為0.4 mol/L，各孔使用的引物濃度在圖上部標出。C：退火溫度優化：引物和探針濃度分別為0.8 mol/L和0.4 mol/L，退火溫度在圖上部標出。圖1 ddPCR引物和探針濃度以及退火溫度的優化Fig.1 Optimization of the primer and probe concentrations and the annealing temperature for ddPCR

綜合考慮熒光信號強度、穩定性和拖尾現象等因素，優化后的反應體系為：ddPCRTM Supermix for Probes l0 μL，上、下游引物(10 mol/L)各1.6 μL，探針(10 mol/L)0.8 μL，核酸DNA模板1 μL補充無菌去離子蒸餾水至20 μL體積。優化后的擴增條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，循環40次；98 ℃酶失活10 min，4 ℃保存至下一步操作。在上述條件下，熒光信號集中，陽性微滴和陰性微滴明顯分開，無拖尾現象，形成最佳的微滴數和擴增效果。

2.2線性區間和靈敏性 標準菌株S3的基因組DNA濃度為30.85 ng/μL，將DNA 2倍梯度稀釋，進行ddPCR線性區間和靈敏性的評價(圖2)。當加入ddPCR反應體系的核酸DNA在0.96 ng/反應～3.68 fg/反應時，ddPCR測得值為2.00×105拷貝/反應～1拷貝/反應，ddPCR測得值的對數值(y)與DNA濃度的對數值(x)有較好的線性關系(y=0.998 6x-0.612 9，R2=0.998 2)。加入每個反應的模板DNA量高于0.96 ng時，因超過了ddPCR的測量能力范圍，ddPCR不能進行定量，而是給出2.00×107拷貝/反應的常數值。

標準菌株S3的基因組DNA2倍梯度稀釋液平行進行熒光定量PCR檢測(圖2)。當加入反應體系的核酸DNA為30.85 ng/反應～3.68 fg/反應時，熒光定量PCR檢測均有擴增曲線，對應的Ct值為11.50～36.20，Ct值(y)與DNA濃度的對數值(x)有較好的線性關系(y=-3.620 8x+38.343，R2=0.998 8)，線性區間比ddPCR寬。

圖2 ddPCR和熒光定量PCR檢測結果隨布魯氏菌DNA量的變化Fig.2 Changes in detection results of ddPCR and real-time PCR with the amount of Brucella DNA

布魯氏菌核酸DNA濃度、ddPCR結果和熒光定量PCR結果見表1，3部分數據反映的變化趨勢基本一致。ddPCR可以直接給出靶標基因拷貝數，實現絕對定量；而熒光定量PCR需要建立標準曲線并根據公式進行換算才能獲得靶標基因拷貝數。

表1 ddPCR和熒光定量PCR檢測結果隨布魯氏菌DNA量的變化Tab.1 Changes in detection results of ddPCR and real-time PCR with the amount of Brucella DNA

2.3特異性 以來自非布魯氏菌種屬的7株菌進行特異性評價。這些菌株3個濃度(1 ng/μL、10 pg/μL和10 fg/μL)的核酸DNA分別以熒光定量PCR和ddPCR進行4次重復檢測，熒光定量PCR皆無擴增曲線，ddPCR皆未檢測到陽性微滴，提示所使用的引物和探針具有高度特異性。

2.4疫情相關血液標本DNA的檢測 2014年發生的布病疫情中，18名工作人員的血液標本中有2個標本、8只羊的血液標本中有3個標本培養出細菌，均為羊種布魯氏菌生物3型菌株[5]。血液標本提取的核酸DNA于-40 ℃凍存，因部分核酸DNA缺失，本研究僅采用17名工作人員和5只羊的血液標本核酸。標本核酸于4 ℃融化后以ddPCR方法進行檢測，發現16份人血液標本為陽性，DNA模板濃度為5～65拷貝/mL血液，平均29拷貝/mL血液，只有1份人血液標本在ddPCR檢測中為陰性，此標本在培養法和試管凝集檢測中皆為陰性；5份羊血液標本全部為陽性，DNA模板濃度為25～245拷貝/mL血液，平均98拷貝/mL血液。

3 討 論

數字PCR從概念提出到商業化生產在短短幾十年間經歷了飛速發展。目前數字PCR主要分為3種：微孔數字PCR、微滴式數字PCR和微腔數字PCR。其中，ddPCR是目前相對成熟的數字PCR技術，其原理是利用油包水乳化，將一定的反應體系分散成上萬個微滴，每個微滴形成一個獨立的、包含或不包含模板DNA的反應體系；PCR擴增后，讀取陽性微滴數，根據泊松分布計算出樣本中的DNA分子數[6-7]。ddPCR已經被用于多種傳染性疾病病原體的檢測，例如HIV-1[8]、結核分枝桿菌[8]等。隨著技術的進一步成熟，ddPCR將在傳染病檢測領域發揮更重要的作用。

布魯氏菌的bcsp31基因在布魯氏菌屬中具有高度保守性和種屬特異性，最常用于人布魯氏菌的診斷[10]；本研究使用針對bcsp31基因的引物和探針，探索最優反應體系和條件，建立了探針法的ddPCR方法。以純培養的標準菌株核酸DNA進行評價，本研究建立的ddPCR方法靈敏性高，可以實現單拷貝模板的檢測。在模板量為0.96 ng/反應～3.68 fg/反應時，ddPCR測得值與模板DNA量有較好的對數線性關系。平行進行的熒光定量PCR檢測也達到了3.68 fg/反應的靈敏性，且線性范圍更寬(30.85 ng/反應～3.68 fg/反應)。但是，熒光定量PCR對模板的定量需要利用已知濃度的模板建立標準曲線，并獲得待檢測標本的信號閾值。信號閾值和標準曲線是測試和儀器專用的，不同的檢測平臺、探針類型和校準標準都會影響所獲得的信號閾值，從而影響原始標本中模板的定量。另外，當模板濃度接近定量下限時，變異系數通常很大。模板中含有擴增抑制因素時，熒光定量PCR的信號閾值會增加，導致對模板量的估計低于實際值。ddPCR的定量是通過分析擴增終點時的產物，而非分析實時擴增過程。擴增抑制因素的存在可能使陽性微滴的熒光信號值降低，但是對陽性微滴的數量影響較小，因此對定量結果的影響較??；同理，ddPCR定量結果受擴增效率的影響也較小[11]。在特異性方面，選擇來自7個其它種屬的菌株進行測試，熒光定量PCR和ddPCR檢測結果皆為陰性，說明使用的引物和探針具有較好的特異性。

雖然ddPCR具有潛在的應用價值，但與熒光定量PCR相比，該方法目前存在一些缺點：需要昂貴的專用設備、試劑和耗材的價格較高、對操作者的技術要求高、檢測通量低，這些因素都限制了該技術的推廣應用。結果報告方面，如何合理地審核和報告低豐度的檢測結果，并做好質量控制，是該方法應用于臨床實踐前需要考慮的要點。

利益沖突：無