生物技術藥物免疫原性檢測中改善藥物耐受研究進展

陳沛卓，洛文靖，程遠國，任欣怡

（1.復旦大學藥學院，上海201203；2.上海益諾思生物技術股份有限公司，上海201203；3.中國醫藥工業研究總院，上海201203）

免疫原性是指免疫系統感知到生物制品中的“外來或非自我”或“危險信號或應激自我”，并對其產生特異性的免疫反應。隨著更多的治療性蛋白在市場上的出現，被治療患者抗藥抗體（anti-drug antibody，ADA）反應的發生率正在上升［1］。所有生物技術藥物都有可能引發宿主免疫反應，這可能會導致無可預估的臨床后果或出現罕見又嚴重的不良事件［2］。非臨床研究表明，它們會中和藥物的活性，影響藥物的清除、血漿半衰期和組織分布，改變藥效或藥動學，使在非臨床研究中觀察到的效應可能并非藥物真正的藥理和（或）毒性反應［3］。臨床研究發現，ADA 與藥物及內源性同系蛋白結合（交叉反應）后，可能會導致該蛋白缺陷綜合征，對藥物的免疫應答導致過敏反應，甚至特異質反應［4］。免疫原性檢測是生物技術藥物臨床安全性評價的組成部分，藥物引起的免疫原性反應（中和抗體和非中和抗體）可影響藥動學、藥效和（或）毒性。因此，在非臨床和臨床研究中監測和評估ADA非常重要。

目前免疫原性檢測方法有很多，常用的檢測方法包括ELISA 如橋聯法（雙抗夾心法）和直接法等、電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）檢測、放射免疫法和表面等離子共振法等。ADA 檢測結果有助于解釋藥物的免疫原性、藥動學、藥效學、安全性和有效性。但是檢測的準確與否取決于分析方法的部分重要參數，如靈敏度和藥物耐受及特異性等。此外，還受其他多種因素的影響，包括檢測方法、樣本處理、樣本采集時間、藥物聯用和疾病狀況等，所以待檢樣本為其主要影響因素之一。由于待檢樣本中的成分較為復雜，既包括游離ADA，也有ADA 與過量藥物結合形成的ADA-藥物復合物，可導致假陰性結果。對于長半衰期抗體藥物，此問題尤其突出［5］。

1 藥物耐受

臨床Ⅲ期關鍵性試驗中所獲得的樣本應使用經過充分驗證的分析方法進行檢測。在申請藥物上市許可時，需要提供該方法經過全驗證的證明數據。全驗證需要證明該方法對于預期的ADA 檢測是適用的，其基本驗證項包括臨界值、靈敏度和藥物耐受、特異性和選擇性、精密度、相關的重現性、某些測定條件的穩健性和關鍵試劑的穩定性。藥物耐受是指在一定陽性對照抗體存在的情況下，可被連續檢測為陽性時的最高藥物濃度，該驗證項的目的是評估生物技術對藥物干擾的抵抗能力，是方法開發中的關鍵因素之一。

因操作方便、快捷及其高通量的檢測能力，ELISA常被用于免疫原性檢測。免疫原性檢測大多采用橋聯ELISA，通過包被藥物，用標記的藥物檢測。此法的優點是能檢測各類抗體亞型，無種屬特異性，可高通量檢測；缺點是不易檢測到低親和力的抗體，包被或標記時可能會掩蓋或改變藥物的抗原表位，易受藥物本身的干擾。直接法則通過包被藥物，用標記抗體檢測。此法的優點是可能增加檢測低親和力抗體的能力，可高通量檢測；缺點是包被時可能會掩蓋或改變藥物的表位，僅檢測單一亞型，有種屬特異性，多次洗滌后低親和力抗體丟失。由于交叉反應的存在，直接ELISA 不適用于治療性單克隆抗體藥物的檢測。

從受試者獲得的血清或血漿樣品是各種因子的復雜混合物，其可能干擾免疫原性測定中ADA 的檢測。樣本中既包括游離的ADA，也有ADA-藥物復合物。藥物本身是干擾因素之一，在待測樣本中藥物的含量過高時，用作捕獲和（或）檢測的標記形式的藥物可能無法與樣品中的未標記藥物競爭［6］，無法形成“夾心復合物”，導致免疫原性測定中潛在的假陰性結果。藥物耐受作為方法開發過程中主要關注點之一，盡可能消除藥物對測定體系的干擾，可改善免疫原性檢測中藥物耐受的問題。

2 改善藥物耐受的方法

改善免疫原性檢測中藥物耐受問題，可以從2 個角度考慮：①將藥物從待測樣本中去除。ADA檢測的主要干擾物質為藥物本身，因此最直接的方法就是將藥物從待測樣本中清除，分離去除游離藥物，減少藥物干擾；②破壞血清中ADA-藥物復合物。當ADA 以復合物的形式存在時，無法參與形成信號通路，使測定信號值比實際偏低，通過酸解離可將ADA從ADA-藥物復合物中解離。

藥物耐受作為免疫原性檢測方法領域的主要挑戰之一，本文歸納目前常用的改善藥物耐受的方法，包括液相ELISA、酸解離、沉淀與酸解離（pre?cipitation and acid dissociation，PandA）、磁珠提取與酸解離（bead extraction and acid dissocia?tion，BEAD）和磁珠提取與熱解離（bead-extraction and heat-dissociation，BEHD）。

2.1 液相ELISA

固相ELISA 是免疫原性測定應用最廣泛的測定方法，其操作簡單，靈敏度高，測定成本低，但其藥物耐受低。為解決藥物耐受低的問題，液相ELISA保留了ECL 平臺的樣品處理方法（均相），即把樣品的前處理置于液體環境中，將生物素標記的藥物和地高辛標記的藥物混合（命名為Master Mix 溶液），待測樣品與Master Mix 溶液進行過夜孵育，使其充分形成免疫復合物。在孵育結束后，用鏈霉親和素包被的板上捕獲免疫復合物，并使用抗地高辛抗體-辣根過氧化物酶和TMB 顯色液進行檢測。液相ELISA更換了檢測系統，保持了ECL的一些優勢［7］，如均相孵育使整個體系處于動態平衡狀態，更有利于形成正確的信號通路，從而提高對游離藥物干擾的耐受性；而且方法穩定可靠，可減少對專用設備的依賴［6］。

2.2 酸解離

通過對樣本進行酸化，使樣品的pH 值處于可使ADA-藥物復合物解離但不失ADA 活性的范圍內，通常選用鹽酸或醋酸進行酸化，于37℃下進行溫育使解離更充分徹底［6］。在檢測前對樣品進行酸解離［8］，可降低樣品中復合物對結果的干擾。需要注意的是，在酸解離后要進行樣品中和，以確保樣品與相應配體橋接，而此時也可使已解離的復合物重新結合，影響實驗結果。因此，需要優化條件如pH 值和酸暴露時間，以實現最大程度地減少干擾。運用酸解離的樣品處理方法有以下2種。

2.2.1 親和捕獲洗脫

親和捕獲洗脫（affinity capture elution，ACE）使用2 塊96 孔板，一塊用于酸化，分離ADA-藥物復合物；另一塊則將ADA 包被于板上，生物素標記的藥物作為檢測試劑，用酶標儀測定吸光度值。用ELISA 系統和ECL 系統對ACE 進行測試后發現，ELISA系統靈敏度更高，藥物耐受更好［4］。

ACE 在正常內源性抗原濃度下無干擾，因此更適合進行免疫原性測定。ACE 敏感度高，藥物耐受高，很少或無內源性抗原干擾或鉤狀效應。ACE 的另一個優點是可以增大檢測信號，用簡單的ELISA即可進行測定。

2.2.2 固相萃取與酸解離

固相萃取與酸解離（solid-phase extraction with acid dissociation，SPEAD）［4］也是一種樣品前處理方法。首先將生物素標記的藥物加入到樣品中，并在室溫下過夜培養。次日將生物素標記的藥物復合物在室溫下結合于鏈霉親和素板。通過酸解離ADA-藥物復合物，消除可能導致干擾分析的過量未結合的藥物和其他血清蛋白，使游離的ADA 直接結合在ELISA板的表面。

這種方法有兩方面的限制［9］：①一些ADA 和（或）中和抗體（neutralizing antibody，Nab）具有高親和力和非常低的解離速率，因此過夜孵育不足以形成生物素-藥物和（或）ADA 復合物的新平衡。②高吸附板具有有限的吸附能力，限制了生物素標記藥物的添加量；如果測試樣品中的藥物過多，添加的生物素標記藥物的有限量只能回收一部分ADA 和（或）NAb，造成藥物耐受差，Nab 檢測準確率低?？偟膩碚f，SPEAD 雖然在敏感性和藥物耐受方面與ACE 非常相似；不同的是SPEAD 中使用鏈霉親和素板去捕獲生物素標記的藥物［10］，消除了放大檢測信號的可能性并導致需要ECL 系統，也意味著對抗原干擾更敏感，且專用儀器和材料的成本增加。

2.3 沉淀與酸解離

盡管上述方法對藥物耐受有所改善，但其無法保持高靈敏度和相對準確性，因此在被治療患者中仍存在假陰性和低ADA 發生率的風險［11］。此方法中聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀的目標分子或ADA-藥物復合物是基于自身相對分子質量的大小，并由PEG 自身濃度所決定。PEG 濃度越高，相對分子質量越低的目標分子越易沉淀。為了減少非特異性血清蛋白如白蛋白和免疫球蛋白的沉淀，常采用低濃度PEG 沉淀相對分子質量高的藥物形成ADA-藥物復合物。利用PandA 在酸性條件下吸附在高容量板的表面（防止重新結合），可用特定的檢測試劑檢測ADA 或目標藥物。PandA 利用沉淀原理和酸解離，先將樣品中加入過量藥物，孵育形成ADA-藥物復合物。盡管有些樣品可能已含有與藥物有關的抗體，但這一步驟可確保樣品中任何剩余的游離ADA 均與藥物結合。然后在樣品中加入PEG 溶液，并在2～8℃下進行過夜溫育，使總ADA 沉淀。第2 天，離心樣品使復合物沉淀成小顆粒，吸出上清液。在最終離心和去除上清液后進行酸解離，將游離ADA 結合在鏈霉親和素板上，而后加入釕標記的藥物，選用ECL進行檢測。

與酸解離相比，PandA 方法的優點在于其在高藥物濃度下仍可完全消除藥物干擾，并且保持測定靈敏度。PEG 沉淀已在文獻中描述用于表征循環免疫復合物［12］，并且使用放射免疫沉淀測定胰島素和胰島素衍生的藥物產品的ADA［13］。無論樣品中存在多少藥物，分析抗體滴度時均可使用該方法。該方法原理可用于減少或消除任何類型免疫測定中的干擾［11］。

2.4 磁珠提取與酸解離和磁珠提取與熱解離

BEAD 方法采用酸解和過量生物素結合2 個步驟從血清中提取ADA［14］。首先酸處理是將ADA 從所有復合物中釋放出來，這些非特異性和特異性復合物可能競爭或阻斷藥物捕獲并引入ADA 假陰性信號，從而低估總ADA 的量。其次通過在鏈霉親和素包覆的磁珠上與過量的生物素標記的藥物結合提取游離ADA。ADA-生物素標記藥物在磁珠上分離并洗滌后，利用酸解作用將其從珠上分離出來，再與可溶性生物素標記藥物結合，捕獲在MSD 板上，ECL直接檢測。

BEAD 預處理已成功應用于ADA 分析驗證，準確度高，并具有有效提高分析靈敏度和消除藥物或基質干擾的能力。BEAD 預處理具有高效率和高準確率的特點，過量生物素標記藥物的添加可充分提取游離ADA，減少損失。該方法原理不僅是ADA測定的有效策略，也是Nab、藥動學和生物標志物分析的有效策略。

盡管BEAD 方法已成功應用于多種NAb 分析，但一篇研究論文中提到，在對15組Nab檢測過程中發現，其中一組Nab 回收率低，原因是其遇酸不穩定，蛋白質結構發生改變，因此不能進行酸處理［9］。這意味著實際測試樣品中存在不耐酸的ADA，并且在BEAD 提取后可能檢測不到。對于酸不穩定的樣本，可選用其他處理方法，如BEHD［9］。

BEHD 與BEAD 類似，均用磁珠進行。不同的是，BEAD 用的是酸解離ADA；而BEHD 則用熱解離ADA。將樣品設定在62℃下振蕩孵育，62℃加熱步驟不僅解離Nab-藥物復合物以取代BEAD 中的酸處理，而且還不可逆地使樣品中的大部分藥物變性，留下完整的NAb。該方法具有良好的準確度、精密度和靈敏度，其方法運用有待于后期更多研究結果。

3 結語

2019 版美國FDA《免疫原性指導原則》［15］指出，藥物耐受可通過使用破壞ADA-藥物復合物的酸解等方法進行改進。由于某些因素如方法選擇性、藥物性質和陽性對照抗體類型等會影響藥物耐受，因此在方法開發過程中要對這些因素進行評估。當藥物是酸不穩定的或靶點性質特殊［13，16］時，酸解離可能會破壞藥物-靶點復合物，釋放多余靶點使得靶點干擾增多，在中和樣品時藥物靶點與捕獲和檢測試劑橋接，導致篩選測定中出現假陽性結果［17］。因此，可以通過在藥物谷濃度水平（CTrough）下收集血清樣本，最大限度地減少來自藥物的干擾。而在方法開發前期，是否對樣本進行酸化，需要對藥物和靶點性質進行綜合評估。

由于藥物干擾的問題，樣品合適的前處理方法可以改善藥物耐受。受試者對藥物產生ADA 的免疫反應風險因產品而異，準確可靠的免疫原性檢測方法可用于評估生物技術藥物的免疫原性或者免疫相關的不良臨床反應。由于酸處理操作簡便被廣泛使用，但酸處理并不適用于所有藥物的免疫原性檢測，van Schouwenburg 等［18］在研究中考察了采用酸處理方法檢測的ADA 結果與實際臨床免疫反應間相關性，受試者為99 例使用阿達木單抗（adalimumab）治療3 年的類風濕性關節炎患者。研究結果顯示，ADA 檢測為陽性和陰性患者在實際臨床療效中無統計學差異，其臨床相關性有限。BEAD 和BEHD 方法由于需要磁珠的參與，檢測成本問題限制了其應用。PandA 方法可以有效消除藥物干擾，但操作步驟復雜，周期長，無法廣泛應用于大樣本的檢測。

生物技術藥物是目前藥物研發的熱點，但幾乎所有的生物技術藥物都會有一定程度的免疫原性，可能會降低藥物療效或導致嚴重的不良反應。因此，生物技術藥物的免疫原性評價越來越受重視。選擇最佳的檢測方法，是抗體藥物發展需要重點考慮的一個環節。雖然方法眾多，但每種方法都有各自的優缺點和針對性，沒有哪一種單一的方法，可以適合所有生物技術藥物免疫原性的評估。因此，在實際方法開發過程中，要根據藥物的實際情況采取最佳的檢測方法。