有氧運動對糖尿病大鼠心臟自主神經病變的影響

邵承穎 蘇冉 王琳 李揚 姚澤龍

摘 要：目的：探討有氧運動對糖尿病大鼠心臟自主神經病變的影響。方法：42只健康雄性SD大鼠隨機分為對照組、糖尿病組、糖尿病+有氧運動組，腹腔內注射鏈脲佐菌素制備糖尿病大鼠模型。糖尿病成模16周后有氧運動組大鼠進行12周跑臺運動。之后所有成活大鼠分別利用心率變異性評估大鼠的電生理特性，利用免疫組化和RT-PCR法檢測左心室心肌膽堿乙酰基轉移酶（ChAT，標記迷走神經）和酪氨酸羥化酶（TH，標記交感神經）陽性神經纖維及其相應的mRNA表達水平。結果：與對照組大鼠相比，糖尿病大鼠心肌ChAT和TH陽性神經纖維的密度及mRNA明顯降低（P<0.01），SDNN、LF、HF等指標均降低，反映交感神經活性的LF/HF比例顯著增加。有氧運動干預后糖尿病大鼠心肌內ChAT和TH陽性神經纖維的密度仍低于對照組，但顯著高于單純糖尿病組（P<0.05），且ChAT/TH神經纖維比例顯著增加，LF/HF比例降低。結論：有氧運動可降低持續高血糖狀態對大鼠心臟交感、迷走神經的損傷，增加迷走神經支配比例，恢復迷走神經與交感神經的平衡狀態，從而顯著改善糖尿病心臟自主神經病變。

關鍵詞：有氧運動; 糖尿病;心臟自主神經病變;交感-迷走神經平衡

中圖分類號：G804.7 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9840（2021）01-0055-05

Abstract：Objective： To investigate the role of aerobic exercise on diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Methods： 42 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups： Control， diabetes mellitus （DM） and DM with aerobic exercise （DM+ME）. Diabetes was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin. 16 weeks after induced DM， the rats in MI+ME group were assigned to 12 weeks of exercise. 12 weeks later， heart rate variability was used to assess electrophysiological?characteristics. Immunohistochemistry and RT-PCR were used to measure choline acetyltransferase （ChAT） and tyrosine hydroxylase （TH） positive nerve fibers and the corresponding mRNA expression levels in the ventricular myocardium. Results： Compared with control rats， the density of ChAT and TH-positive nerve fibers and mRNA expressions were decreased in DM group， the SDNN （P<0.01）， LF and Hf were decreased and LF/HF ratio was increased. The density of ChAT and TH-positive nerve fibers in DM+ME group was higher than that in DM group （P<0.05）， especially， the ChAT/TH ratio in DM+ME group was higher and LF/HF ratio was lower than that in DM group. Conclusions： Aerobic exercise may ameliorate diabetes-induced sympatho-parasympathetic imbalance and increase the ratio of parasympathetic to sympathetic nerve fibers.

Key words：aerobic exercise; diabetes mellitus; cardiac autonomic neuropathy; sympatho-parasympathetic balance

糖尿病（diabetes mellitus， DM）是21世紀對人類健康最具挑戰的疾病之一，其慢性并發癥可損害全身各系統，是糖尿病患者致殘、致死的主要原因。其中，糖尿病心臟自主神經病變（diabetic cardiovascular autonomic neuropathy， DCAN）是最為嚴重的類型之一，流行病學研究顯示大約60%～90%的糖尿病患者并發DCAN。DCAN其主要臨床表現為心動過速、運動耐力下降、體位性低血壓、無痛性心肌缺血，其中最嚴重的表現為室性心律失常及心源性猝死[3]。近年來一系列研究證實，長期高血糖狀態對心臟自主神經影響廣泛，交感神經及迷走神經均有受累。由于迷走神經節前纖維較長，對缺氧耐受性差，故在DCAN中，迷走神經損傷較早且較重[4];而后期迷走神經、交感神經均不同程度受累，這種支配失衡勢必打破心臟交感-迷走神經的平衡，改變心電穩定性，導致心律失常易感性的增加。但目前尚無針對糖尿病自主神經病變的特效治療方法，傳統藥物治療效果不佳。

近幾年，有氧運動作為心血管疾病重要的康復手段逐漸成為運動醫學領域研究的熱點，2010年美國運動醫學會/美國糖尿病學會糖尿病運動指南[6]中明確指出，規律的體育運動可以有效控制糖尿病患者血糖水平，增加胰島素敏感性，還有利于減輕體重、控制血脂和血壓、降低大血管和微血管等并發癥發生風險，因此建議糖尿病患者應在醫生指導下盡可能增加運動和日常活動。隨著有氧運動相關研究的繼續深入，有氧運動對糖尿病周圍神經及心臟自主神經病變的改善作用也得到了越來越多的關注。意大利一項為期4年的研究[8]發現，長期有氧運動可顯著提高2型糖尿病患者腓腸肌運動神經傳導速度，并進一步延緩糖尿病周圍神經病變的發生、發展進程。Pagkalo等[9]對17例2型糖尿病患者進行了為期6個月的每周3次的有氧運動訓練，證實長期中等強度的有氧運動訓練可提高心臟迷走神經活性，顯著改善2型糖尿病患者的心臟自主神經功能。目前，有氧運動對心臟自主神經改善的探討多集中在功能性研究，而其對心臟自主神經解剖方面的機制尚不明確。因此，本研究擬在DM大鼠模型基礎上，觀察12周有氧運動對心臟自主神經及心臟電生理特性的影響，以闡明有氧運動改善心臟自主神經功能解剖學機制，為DCAN的治療提供新的思路及理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性SD大鼠42只，體重200～250 g（購自山東大學實驗動物中心）。Trizol試劑盒購于北京TransGen公司; Real-time RT-PCR試劑盒購于大連寶生物工程公司，引物由上海生工生物工程公司設計并合成;膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT） 及酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）一抗均購于美國Millipore公司，二抗均購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病模型制備

大鼠適應性喂養1周，隨機分為3組：對照組（n=14），糖尿病組（n=14），糖尿病+有氧運動組（有氧運動組，n=14）。依照參考文獻制備糖尿病大鼠模型：所有大鼠禁食不禁水12 h，腹腔內注射鏈脲佐菌素（50 mg/kg），對照組大鼠給予同等體積的生理鹽水腹腔內注射。糖尿病定義為鏈脲佐菌素腹腔內注射后48 h連續2次尾靜脈血測定空腹血糖>16 mmol/L。在模型制備后第16周檢測空腹血糖及體重。

1.2.2 運動方案

糖尿病大鼠成模后第16周，有氧運動組參照Kemi OJ運動方案進行訓練：動物跑臺運動速度為15 m/min，大鼠進行適應運動10 min;將跑臺運動速度增至20 m/min，持續運動50 min。大鼠運動60 min/d，5次/周，共計12周。對照組及糖尿病組正常籠內喂養不運動。

1.2.3 心率變異性（heart rate variability，HRV）分析

實驗大鼠12周有氧運動干預后，所有成活大鼠參照Sgoifo等[12]的方法將小動物無線遙測植入子植入大鼠腹腔內。一個電極置于大鼠劍突下，另一個置于靠近右心房的縱膈內。利用LabChart Pro軟件記錄24 h動態心電圖。選取一段15 min的心電圖記錄分析心率變異性。計算出正常R-R間期的標準差（standard deviation of normal-to-normal，SDNN）。同時記錄低頻（LF：0.04～0.15 Hz）和高頻（HF：0.15～0.4 Hz）數據，計算低頻和高頻的比值。

1.2.4 心肌標本處理

HRV分析結束后，大鼠再次麻醉并迅速取下心臟，經主動脈灌注生理鹽水清除殘存血液。并選取左室近段（心底前壁）心肌組織，分別存放于中性甲醛及液氮中保存。

1.2.5 ChAT及TH陽性神經纖維密度測定

取甲醛固定后的心肌組織，石蠟包埋，切片，片厚4 μm，常規脫蠟、高壓修復后加一抗4℃過夜，二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，復染后封片。采用Image Pro Plus 5圖像處理分析軟件定量分析ChAT、TH陽性神經纖維在所選區域中所占面積（以μm2/mm2表示），每張切片選取神經分布最集中的3個區域，取其平均值作為陽性神經纖維密度值。

1.2.6 ChAT及TH mRNA檢測

按照Trizol 試劑盒提供的方法提取心肌組織總mRNA。采用上海生工生物工程公司設計的引物，GAPDH 作為內參。TH引物， 上游ACT GGA GGC TGT GGT ATT TGA G;下游GAG ACA AGG AGG AGG AGG GTT TTG。 ChAT引物，上游AGC CCC TCT GTA TGA AGC AAT ;下游GGA CGC CAT TTT GAC TAT CTT T; GAPDH引物， 上游ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC;下游TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT。按照RT-PCR 試劑盒的方法進行熒光定量PCR，使用GAPDH 標準化，采用2 –ΔΔCT法計算目的基因轉錄水平。

1.2.7 統計學分析

所有數據均采用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差（x2±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，然后采用最小顯著差異法進行組間兩兩比較。P<0.05為統計學差異具有顯著性。

2 結果

2.1 動物一般情況

實驗過程中， 非糖尿病對照組大鼠精神狀態良好，體重增加明顯。糖尿病組大鼠出現多食、多尿和消瘦等癥狀，實驗期間各組大鼠各階段空腹血糖及體重變化情況見表1。

2.2 心肌中ChAT及TH陽性神經纖維分布及表達

如圖1所示，對照組ChAT（迷走神經標志物）和TH（交感神經標志物）陽性的神經纖維均勻分布在心室肌周圍，沿心肌纖維縱行分布，但ChAT陽性神經纖維較TH陽性神經纖維相比較為稀疏。糖尿病大鼠ChAT和TH陽性神經纖維的密度顯著低于對照組，而有氧運動組ChAT和TH陽性神經纖維的密度顯著高于糖尿病組，且ChAT/TH神經纖維比例明顯升高（表2）。

2.3 大鼠心肌中ChAT、TH相應mRNA表達水平

與對照組相關，糖尿病大鼠心肌組織中ChAT及TH mRNA均顯著下調（ChAT：0.379±0.044 vs. 0.979±0.087， P<0.01;TH：0.523±0.066 vs. 0.997±0.092， P<0.01）;而有氧運動干預后，ChAT及TH mRNA表達均有不同程度的上調（ChAT：0.531±0.071 vs. 0.379±0.044，P<0.05;TH：0.683±0.113 vs. 0.523±0.066， P<0.05）（圖2）。

2.4 HRV分析

如表3所示，糖尿病大鼠SDNN顯著低于對照組大鼠，而有氧運動組SDNN高于糖尿病組。記錄LF和HF數值行頻域分析，有氧運動組中二者均明顯高于單純糖尿病組，更重要的是，有氧運動組LF/HF明顯低于糖尿病組。

3 討論

在正常生理情況下，交感神經及迷走神經以其“固有”的形式分布于心臟，二者相互依存、相互對抗、相互協調，共同精細地調節心臟活動。其中，交感神經興奮時表現為正性頻率、正性傳導和正性肌力的“三正”作用，其過度興奮可誘發心律失常;而迷走神經興奮時表現為相反的“三負”作用， 在一定程度上起到抗心律失常的作用。慢性高血糖可引發心臟自主神經病變，通過電鏡觀察，糖尿病自主神經損害表現為脫髓鞘病變（節段性脫髓鞘病變為主），可見軸索的神經微絲溶解及小泡性膜狀細胞器出現。有研究發現DCAN的交感神經去神經化最先發生在左室的遠端，然后逐漸向近端擴展，顯示出交感神經病變嚴重程度自左室近端至遠端呈逐漸加重的“階梯狀分布”。而迷走神經纖維也呈現不同程度的密度降低，由于迷走神經節前纖維較長，且對缺氧耐受性差，故DCAN中迷走神經損傷較早且較重，提示交感神經、迷走神經均不同程度受累，但以迷走神經損害為主。這種支配失衡勢必打破心臟交感-迷走神經的平衡，改變心電穩定性，導致心律失常易感性的增加。

與既往研究結論一致，我們的結果顯示，糖尿病大鼠心肌中ChAT和TH陽性神經纖維的密度及其相應mRNA表達明顯降低，ChAT/TH神經纖維比例也顯著下降，提示持續高糖狀態對心臟交感及迷走神經損傷及失支配狀態，尤以迷走神經損傷更為嚴重。HRV分析作為一種無創的檢查方法，不僅對心臟交感神經功能可以做出評價，還可以對迷走神經功能以及迷走/交感神經功能之間的均衡性進行定量分析[16]。我們的研究結果顯示，糖尿病組SDNN、LF、HF等指標均明顯低于正常對照組，且LF/HF較正常對照組高，提示糖尿病對心臟自主神經造成交感、迷走神經功能不同程度受損，交感神經張力相對上調，最終導致心肌交感-迷走神經的功能失衡。

糖尿病心臟自主神經病變病理生理學機制涉及多種細胞及代謝途徑[17]，包括：糖代謝紊亂本身對心臟自主神經纖維產生的損傷;神經微循環障礙造成的神經元缺血、缺氧;氧化應激的參與;自身免疫機制引起的損害;神經生長因子水平的降低以及免疫因素的參與等。因其涉及機制繁多，臨床上單一藥物干預均未獲得理想的防治效果。因此，如何改善DCAN成為臨床工作的難點和熱點。近年來，關于有氧運動對心臟自主神經調控的研究已有諸多報道，Hautala等[18]在校正受試者年齡、訓練時間等因素后發現，每周進行3次30 min預計最大心率60%至80%強度范圍的有氧運動，并持續4周以上，可顯著增強心臟迷走神經張力;Zoppini等以2型糖尿病患者為研究對象，通過對心率變異性的動態監測發現有氧運動可降低LF/HF的比值，提示有氧運動可改善糖尿病患者心臟交感-迷走平衡，降低交感或增強迷走神經張力。Howorka等[20]的研究發現，對于合并早期心臟自主神經病變的糖尿病患者，3個月的運動訓練可提高心率變異性并顯著改善自主神經功能;然而，對于合并嚴重的心臟自主神經病變患者，運動訓練對心率變異性影響相對較小。但是，上述研究多集中于有氧運動對自主神經功能性研究，其涉及的解剖以及分子學機制尚不明確。在本研究中，我們重點探討有氧運動對心肌交感及迷走神經密度、支配的影響，以期提供最直接的解剖學證據。本研究結果發現，與單純糖尿病組相比，有氧運動組大鼠心肌中ChAT和TH陽性神經纖維及其mRNA水平均明顯增加，提示有氧運動可減緩或改善高糖狀態對心肌交感-迷走神經的損傷;更重要的是，降低迷走神經過度損傷，進而升高迷走/交感神經支配比例，并顯著降低LF/ HF，提示有氧運動不僅可以相對增加迷走神經數量，也同樣上調迷走神經張力，逆轉并改善糖尿病對心臟自主神經結構及功能的損害。因此，我們認為，有氧運動可降低持續高血糖狀態對大鼠心肌中交感、迷走神經的不均衡損傷，改善自主神經失支配狀態，并相對增加迷走神經支配比例，這也可能是有氧運動降低交感神經張力、增強迷走神經張力的可能機制之一。

但有氧運動如何發揮對自主神經的保護作用？其可能解釋如下：第一，有氧運動可增加胰島素敏感性，顯著降低糖尿病患者血糖水平[6]，降低高糖對心臟自主神經纖維產生的直接損傷，發揮神經保護作用。 第二，有氧運動通過上調延髓頭端腹外側區CuZn超氧化物歧化酶，抑制NAD（P）H氧化酶亞基gp91phox蛋白表達，發揮中樞性抗氧化應激作用，從而避免機體過度氧化應激對心臟自主神經纖維的持續損傷。我們的研究從解剖角度證實有氧運動對DCAN的逆轉作用及改善心臟交感-迷走支配失衡的可能機制，為DCAN的預防及治療提供新的思路及理論依據。

4 結論

本研究證實有氧運動可降低持續高血糖狀態對大鼠心臟交感、迷走神經的損傷，增加迷走神經支配比例，恢復迷走神經與交感神經的平衡狀態，改善DCAN所導致的心臟自主神經失衡，促進心臟電生理的穩定性。該結果提示在DCAN和由其繼發的室性心律失常治療方面，有氧運動可能成為一種潛在的有效預防及治療措施。

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