靈芝多糖抗腫瘤免疫調節機制的研究進展①

李亞晗 劉佳琳 王天添 劉玟妍 孫麗媛 李明成（北華大學醫學技術學院，吉林 132013）

靈芝（G.lucidum）具有補益、益氣、強心等神奇的藥用功效，幾千年來一直被用作促進身體健康、永葆青春活力、延年益壽的良藥。現代醫學研究表明靈芝具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗血糖、抗潰瘍、抗癌和免疫刺激作用，尤其是它被認為是癌癥的一種替代性輔助療法［1‐2］。靈芝含有多種成分，例如糖蛋白、多糖、三萜、類萜、倍半萜、類固醇、生物堿、苯并吡喃衍生物和苯甲酸衍生物，它還包含一些礦物質，例如鉀、鈣、磷、鎂、硒、鐵和鋅［3］。研究發現靈芝的抗癌特性主要歸因于其多糖和三萜。靈芝多糖（ganoderma lucidum polysaccha-ride，GLP）由（1→3）、（1→6）‐α/β‐葡聚糖、糖蛋白和水溶性雜多糖組成。GLP通過多種機制，如抗增殖、促凋亡、抗轉移、抗血管生成、抗炎、抗氧化和免疫調節作用，通過抑制腫瘤生長和轉移，增強患者的免疫功能來執行抗癌作用［4］。

宿主免疫監視在識別和摧毀癌變的宿主細胞方面起著至關重要的作用，因此免疫治療已成為癌癥防治的主要策略之一［5］。越來越多的研究表明，GLP部分通過刺激免疫功能發揮抗癌作用。這主要歸因于GLP可以激活T和B淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）和天然殺傷（natural killer cell，NK）細胞，它促進淋巴細胞的增殖，增強吞噬作用，增加細胞因子的產生，并增強NK細胞介導的細胞毒性作用。本文將重點討論GLP的免疫調節抗癌作用及其潛在機制。

1 靈芝多糖對固有免疫系統的調節作用

1.1 GLP對巨噬細胞的影響巨噬細胞是免疫系統的“吞噬者”，吞噬并消化凋亡細胞和病原體（稱為吞噬作用），并產生免疫效應分子［5］。GLP的體內治療會激活肉瘤S180小鼠骨髓源性巨噬細胞，從而產生免疫調節物質，例如IL‐1β，TNF‐α和一氧化氮（NO）。GLP顯著提高巨噬細胞吞噬功能，增強巨噬細胞介導的腫瘤細胞毒性。同樣，GLP在體外激活巨噬細胞，并在培養基中增加各種細胞因子的水平，包括IL‐1β、腫瘤壞死因子（TNF）‐α、IFN‐γ和IL‐6［6］。GLP是小鼠腹腔巨噬細胞分泌MAPKs和Syk依賴性TNF‐α和IL‐6的誘導因子。Dectin‐1受GLP刺激，但類似Toll樣受體4（TLR4）的信號傳導并不參與GLP的生物學活性［7］。然而，TLR4的信號傳導是否參與GLP的生物活性是有爭議的，因為GLP被發現直接與TLR4、B細胞細胞膜Ig（membrane Ig，mIg）、7S核糖體蛋白和bZIP增強劑結合，并通過TLR4傳遞某些信號。除了GLP對上述細胞因子和趨化因子表達的影響外，GLP還誘導炎癥細胞因子IL‐1的表達，這在一定程度上與其抗癌活性有關。GLP可上調人巨噬細胞和小鼠巨噬細胞IL‐1的分泌，上調IL‐1前體pro‐IL‐1和IL‐1轉化酶的表達［8］。這歸因于蛋白酪氨酸激酶/蛋白激酶C/MEK1/細胞外信號調節激酶（ERK）和蛋白酪氨酸激酶/Rac1/p21激活激酶/p38途徑的激活［9］。

1.2 GLP對NK細胞的影響與細胞毒性T細胞不同，NK細胞在沒有抗體和主要組織相容性復合物的情況下可以識別應激細胞，從而加快免疫反應，因此NK細胞對先天免疫至關重要［10］。結果表明，GLP可使人臍血單個核細胞中CD14+CD26+單核/巨噬細胞、CD83+CD1a+DCs和CD16+CD56+NK細胞的數量分別增加2.9、2.3和1.5倍。此外，GLP能將NK細胞介導的細胞毒性提高31.7%。口服靈芝提取物可增加1型T輔助細胞和巨噬細胞分泌細胞因子（IL‐6和IFN‐γ）的水平，并增強BALB/c小鼠的NK細胞活性和吞噬作用［11］。GLP部分與TLR‐4受體結合，激活ERK、c‐Jun N末端激酶（JNK）和p38 MAPK。GLP可刺激小鼠脾細胞IL‐1、IL‐6、IL‐12、IFN‐γ、TNF‐α、粒細胞‐巨噬細胞集落刺激因子（GM‐CSF）、粒細胞集落刺激因子（GCSF）和巨噬細胞集落刺激因子（M‐CSF）的表達［12］。GLP可增加小鼠脾臟DCs、CD4、CD8、調節性T、B和NK細胞的數量。低劑量GLP減輕了環磷酰胺引起的小鼠體重、NK活性、IFN‐γ產生和細胞毒性T淋巴細胞活性的降低，并抑制由于環磷酰胺給藥引起的IL‐4水平的異常升高或降低［13］。慢性給藥2.5 mg/kg GLP可加速骨髓細胞、紅細胞、白細胞、脾臟NK細胞和NK細胞的恢復，增強T細胞和B細胞的增殖反應。增強巨噬細胞的吞噬和細胞毒性，并無明顯副作用［14］。因此，低劑量GLP治療可以加速免疫抑制小鼠從白細胞減少、骨髓抑制和免疫抑制中恢復，這對癌癥化療是有益的。

1.3 GLP對DC細胞的影響DC細胞是重要的專業抗原呈遞細胞，對于啟動輔助T細胞和細胞毒性T淋巴細胞的初次免疫反應是必需的［15］。GLP具有刺激正常人單核細胞衍生DC細胞和白血病單核細胞衍生DC細胞成熟的能力。GLP增加CD80、CD86、CD83、CD40、CD54和人類白細胞抗原DR（HLA‐DR）的細胞表面表達［16］。它還增強了IL‐12p70、IL‐12p40和IL‐10的產生。GLP誘導的人單核細胞源性DCs的活化和成熟是通過活化B細胞的核因子kappa輕鏈增強子（NF‐κB）和p38絲裂原活化 蛋 白 激 酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）途徑介導的［17］。GLP（0.8、3.2或12.8 mg/ml）可增加培養的骨髓來源樹突狀細胞表面CD11c和I‐A/I‐E分子的共表達，提高DCs中細胞因子IL‐12p40的mRNA表達，增加培養上清液中IL‐12p40蛋白的產生。GLP還增強了成熟DC細胞誘導的混合淋巴細胞培養物中淋巴細胞的增殖。用GLP（100μg/ml）處理白血病單核細胞系THP‐1和U937可顯著增加HLA‐DR、CD40、CD80和CD86的表達［18］。GLP通過促進細胞黏附、超氧化物產生、細胞周期阻滯和CD11b、CD14、CD68、MMP‐9、髓過氧化物酶等分化標志物的表達，誘導THP‐1白血病細胞向巨噬細胞樣細胞分化。此外，GLP誘導的caspases和p53激活也有助于這種分化［19］。

2 靈芝多糖對T/B細胞的調節作用

2.1 GLP對T淋巴細胞的影響大量研究表明GLP是T淋巴細胞的活化劑。GAO等［20］研究表明，GLP能夠顯著增加小鼠細胞毒性T淋巴細胞對靶細胞的殺傷力以及NK細胞的活性。用GLP治療可顯著促進伴刀豆球蛋白A（concanavalinA，ConA）誘導的小鼠淋巴細胞增殖和IL‐2的產生［21］。GLP還能促進脾細胞增殖以及細胞因子如IL‐1α、IL‐1β、IFN‐γ、TNF‐α和TNF‐β的產生。有研究表明GLP還可以通過誘導DNA聚合酶α的表達，促進混合淋巴細胞培養中小鼠脾細胞的DNA合成。GLP可增加T淋巴細胞中IFN‐γ的表達以及小鼠脾細胞中IL‐1、IL‐2和IFN‐γ的表達。GLP增加靜息T細胞中三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycer-ol，DAG）的生成，盡管它不影響ConA激活T細胞中IP3和DAG的生成，這表明IP3/Ca2+和DAG/蛋白激酶C（protein kinase，PKC）途徑可能參與GLP對T細胞的免疫調節作用。進一步的研究表明，GLP可以激活鼠T細胞中的PKC和蛋白激酶A（protein ki-nase A，PKA）［22］。

B16F10黑色素瘤細胞可在細胞培養基中分泌大量IL‐10、轉化生長因子β1（transforming growth factor，TGF‐β1）和血管內皮生長因子（vascular endo-thelial growth factor，VEGF）。研究表明，B16F10細胞培養上清液能抑制植物血凝素（phytohemaggluti-nin，PHA）刺激穿孔素和顆粒酶B的產生，抑制淋巴細胞的增殖。有趣的是，添加GLP可以完全或部分拮抗B16F10細胞培養上清對淋巴細胞的抑制作用［23］。GLP還能防止B16F10細胞減少淋巴細胞中CD71和Fas配體（FasL）的表達。此外，肺癌患者的血漿可抑制PHA激活的淋巴細胞的增殖，CD69表達以及穿孔素和顆粒酶B的產生，而這些成分也可以通過GLP治療完全或部分逆轉。用GLP處理B16F10黑色素瘤細胞和淋巴細胞的共培養物可增加培養基中CD69（T細胞活化和增殖的共同刺激分子）、FasL和IFN‐γ的產生［24］。

2.2 GLP對B淋巴細胞的影響B淋巴細胞在體液免疫中起重要作用，與T細胞或NK細胞不同，B細胞在其細胞膜上表達B細胞受體，使B細胞結合特定抗原并產生針對該抗原的抗體，此外，B細胞也呈 遞 抗 原 并 分 泌 細 胞 因 子［25］。GLP激 活mIg和TLR4，后者發送信號激活B細胞，并通過核糖體蛋白s7和轉錄輔激活劑（胞內蛋白）啟動巨噬細胞激活過程［26］。GLP可以通過增加B細胞的增殖和分化來激活B細胞。據報道GLP不僅使B細胞的百分比增加了2.5～4倍，而且還增加了B細胞的大小。同樣，在體內用GLP治療還可以激活脾臟和骨髓來源的肉瘤S180小鼠的B淋巴細胞，并誘導B細胞增殖和在小鼠中產生大量免疫球蛋白。從機制上講，GLP可通過直接刺激B細胞中PKCα和PKCγ的表達來誘導B細胞表面CD71和CD25的表達，并增加B細胞免疫球蛋白的分泌［27］。

3 靈芝多糖對細胞因子的影響

3.1 增加抗腫瘤的細胞因子GLP在荷瘤小鼠體內治療可提高小鼠血清中12種細胞因子和趨化因子的水平，包括KC（CXCL1）、MCP‐1（CCL2）、IL‐6、MIP‐1β（CCL3）、IL‐1β、IL‐12p40、IL‐12p70、RANTES（CCL5）、IL‐1α、TNF‐α、IL‐10和IL‐13［28］。GLP能增強晚期癌癥患者的免疫反應。在一項非隨機開放臨床試驗中，74例晚期結直腸癌患者以5.4 g/d的劑量服用GLP，持續12周。結果發現，GLP能提高CD3、CD4、CD8和CD56淋巴細胞計數，也能提高PHA的有絲分裂反應性、血漿IL‐2、IL‐6、IFN‐γ濃度以及NK活性，但降低血漿IL‐1和TNF‐α濃度。在另一項臨床試驗中，34例晚期癌癥患者3次/d服用1 800μg的ganopoli（GLP提取物），為期12周。這導致血漿中IL‐2、IL‐6和IFN‐γ的平均濃度升高，IL‐1和TNF‐α的水平降低。在CD4∶CD8 T細胞比率不變的情況下，CD56+細胞的平均絕對數也增加，CD3+、CD4+或CD8+的數量與基礎水平相比僅略有增加。此外，與基線相比，治療導致平均NK活性顯著增加［29］。

3.2 抗炎作用一些炎癥介質，如TNF‐α、IL‐6、TGF‐β和IL‐10，已經被證明參與了癌癥的發生和發展。GLP具有劑量依賴性的抗炎作用。服用GLP（100 mg/kg）可導致58%的炎癥抑制，如卡拉膠誘導（急性）和福爾馬林誘導（慢性）炎癥試驗所評估的［30］。GLP在體內外對O2‐，SO，HO˙，H2O2和2，2‐二苯基‐1‐吡啶酰肼（DPPH）具有較強的清除活性。研究表明，5 mg/ml的GLP提取物能在2 min內顯著降低DPPH自由基，15 min內完全清除DPPH自由基。GLP提取物通過Nrf2介導的信號通路在體外誘導結直腸癌組織中超氧化物歧化酶（superoxide dis-mutase，SOD）、過氧化氫酶、Ⅱ期脫毒酶、醌氧化還原酶1（NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1）和谷 胱 甘 肽S‐轉 移 酶P1（glutathione S‐transferase，P1GSTP1）［31］。GLP還能增強SOD和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，并以劑量依賴的方式降低暴露于γ射線照射的小鼠或宮頸癌大鼠體內的丙二醛水平。

4 小結與展望

臨床前和臨床研究表明，GLP不僅具有抗腫瘤細胞增殖、促凋亡和抗遷移作用，而且具有抗血管生成和免疫調節作用。因此，聯合應用GLP有利于腫瘤患者接受常規化療和/或放療，有助于提高患者的免疫功能，減輕常規治療的毒副作用。然而，仍然需要更多的研究來進一步闡明免疫調節作用的機制以及GLP的直接抗癌作用，特別是為不同的病人群體設計更為合理的臨床試驗也是必要的。