人參皂苷Rg1調節氧化應激和炎癥因子表達改善糖尿病大鼠周圍神經損傷①

吳麗娜 范曉萌 武爽 郭紅艷 徐晶 劉穎 黃丹璇 張春晶趙正林

（齊齊哈爾醫學院醫學技術學院，齊齊哈爾 161006）

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neu-ropathy，DPN）是目前糖尿病最常見的慢性并發癥之一，發病率高達50%以上；隨著病程延續，嚴重者會造成截肢，致殘率較高。DPN的發病機制復雜，至今尚未明確，多數研究者認為其與體內代謝紊亂導致的神經營養因子含量變化、微循環障礙與血管損傷、氧化應激、細胞炎癥因子的堆積等因素有關［1‐2］。因其復雜的發病機制，臨床上DPN尚無規范而效果良好的治療藥物。目前，中藥治療DPN受到廣泛關注，而人參是常用的名貴藥材，具有大補元氣、養血生津、寧心益智等功效。人參皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1，G‐Rg1）是人參的主要活性成分，具有多種生物學功效，包括調節內分泌系統和神經系統、增加機體免疫功能、調節血糖、抗腫瘤、抗氧化等多方面作用，其中包括對神經組織的再生與營養改善作用和保護作用［3‐4］。本研究利用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘發大鼠Ⅱ型糖尿病及其周圍神經病變模型，觀察G‐Rg1對DPN結構和功能的改善作用；同時，檢測血清和組織中的氧化應激和炎癥因子水平，檢測氧化應激信號通路中核因子E2相關因子（nuclear fac-tor erythroid‐2‐related factor 2，Nrf2）及其下游基因血紅素加氧酶‐1（heme oxygenase‐1，HO‐1）以及炎癥信號通路中NF‐κB的表達變化，探索G‐Rg1對糖尿病大鼠坐骨神經損傷的保護作用及其機制，為G‐Rg1的進一步研發提供可靠的基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑G‐Rg1購自韓國嶺南藥業公司，純度高于98%；STZ購自美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片（0.85 g/片）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；兔抗大鼠Nrf2、HO‐1、NF‐κB抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Cell Signaling Technology；TNF‐α（貨號F16960）和IL‐6（貨號F15870）檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；TNF‐α、IL‐6和GAPDH引物由上海生工生物技術公司合成；TRIzol總RNA提取試劑盒、qPCR試劑盒購自美國Invitro-gen；HiFiScript cDNA合成試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；ROS測定試劑盒、MDA測定試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.1.2 儀器MDABL‐420E+生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；瑞典LKB‐2088型超薄切片機（瑞典LKB公司）；EM‐1200EX型透射電子顯微鏡（日本JEOLJ公司）；電泳設備以及圖像分析系統（美國Bio‐Rad公司）；Q5實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.1.3 實驗動物雄性健康SD大鼠體重為180～200 g，由齊齊哈爾醫學院實驗動物中心提供和飼養。在溫度20～25℃、濕度30%～35%自動空氣清潔設備條件下飼養，自由攝食。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立、分組和給藥取雄性健康SD大鼠80只，適應性喂養1周后，隨機選取10只為正常對照組，給予標準飼料喂養；其余大鼠高糖高脂喂養4周后，禁食8 h，以0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH4.2）將STZ配成1%的溶液，40 mg/kg腹腔注射大鼠，正常對照組大鼠注射等量檸檬酸鈉緩沖液。注射藥物72 h和2周后，血糖測試儀取尾靜脈血測空腹血糖，2次檢測均大于11.1 mmol/L作為糖尿病大鼠模型［5］。糖尿病大鼠隨機分為模型組、G‐Rg1小劑量組、G‐Rg1大劑量組和二甲雙胍（Metformin）陽性對照組，10只/組。分組后立即開始給藥，G‐Rg1小劑量組和大劑量組分別每日灌胃1次劑量分別為10 mg/kg和30 mg/kg的G‐Rg1，二甲雙胍陽性對照組每日灌胃1次100 mg/kg的二甲雙胍，連續給藥8周［6］。正常對照組和模型組灌胃等量無菌蒸餾水。

1.2.2 坐骨神經傳導速度的檢測［7］末次給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，俯臥位固定，沿坐骨神經走行切開皮膚，暴露坐骨神經，利用BL‐420E+生物機能實驗系統記錄近、遠端坐骨神經產生動作電位的潛伏期，測定兩記錄電極間的距離，按公式計算坐骨神經傳導速度。運動神經傳導速度（motor nerve conduction velocity，MNCV）=記錄電極間距離/動作電位潛伏期差值；感覺神經傳導速度（sensory nerve conduction velocity，SNCV）測定時將刺激電極置于同側足背，記錄電極置于近端坐骨切跡處的電位。SNCV=刺激電極與記錄電極間距離/潛伏期。重復刺激3次后取平均值。測定坐骨神經運動傳導速度后，取大鼠右側部分坐骨神經標本，立即冷凍備用于電鏡觀察。

1.2.3 電子顯微鏡觀察坐骨神經形態學變化取坐骨神經，經戊二醛、餓酸雙重固定以及系列丙酮脫水，EPON812和815混合樹脂包埋后，進行半薄切片，經醋酸鈾‐檸檬酸鉛雙重染色后，透射電子顯微鏡觀察坐骨神經有髓神經及無髓神經纖維的超微結構變化。

1.2.4 測定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）及血清中炎癥因子TNF‐α和ⅠL‐6水平末次給藥后1 h，取尾靜脈血用血糖測試儀檢測各組大鼠FBG。實驗結束后，收集大鼠全血，離心后取血清，ELISA法測定各組大鼠血清中炎癥因子TNF‐α和IL‐6水平，實驗嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 坐骨神經組織中MDA和ROS的含量測定取左側坐骨神經組織后用0.9%生理鹽水制備勻漿，離心后取上清液，按照試劑盒說明測定各組坐骨神經MDA和ROS含量。

1.2.6 qPCR法 檢 測 坐 骨 神 經TNF‐α和ⅠL‐6 mRNA表達處死實驗動物后，提取坐骨神經總RNA，按照試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，實時定量PCR儀擴增。各引物序列如下：TNF‐α，F：5′‐AGGGAATTGTGGCTCTGGT‐3′，R：5′‐AGGCCACT‐ACTTCAGCGTCT‐3′，擴增片段為190 bp；IL‐6，F：5′‐ATTCTGTCTCGAGCCCACCA‐3′，R：5′‐AGGCA‐ACTGGCTGGAAGTCT‐3′，擴增片段為133 bp；GAP-DH，F：5′‐GACAAGATGGTGAACTGTCGGT‐3′，R：5′‐CTTTGGCATCGTGGAAGGGCTC‐3′，擴增片段為108 bp。擴增條件為95℃預變性2 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s、72℃延伸30 s，共進行38個循環。利用qPCR數據分析系統軟件，以相對定量值進行統計分析。

1.2.7 Western blot檢測蛋白水平取坐骨神經組織勻漿上清液，按照蛋白濃度檢測試劑盒說明進行蛋白質定量。用已獲得的各組蛋白質按照常規操作方法進行電泳、轉膜，分別加入特異性Ⅰ抗4℃反應24 h，再加入Ⅱ抗孵育1 h后，ECL顯色。利用圖像分析系統掃描，以β‐actin為對照。

1.3 統計學處理采用Grappad prism 5.0統計軟件進行分析。數據均采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One‐Way ANOVA），組間兩兩比較采用Newman-Keuls法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 G‐Rg1對糖尿病大鼠空腹血糖及坐骨神經MNCV和SNCV的改善作用由表1可知，模型組大鼠FBG顯著高于正常對照組，而G‐Rg1大劑量組FBG與模型組相比明顯降低（P＜0.05），G‐Rg1小劑量組大鼠FBG與模型組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；G‐Rg1大劑量組大鼠FBG與G‐Rg1小劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組大鼠坐骨神經MNCV和SNCV與正常對照組相比明顯減慢（P＜0.05）；G‐Rg1連續給藥8周后，G‐Rg1小劑量組和大劑量組大鼠坐骨神經MNCV和SNCV均有改善（P＜0.05），同時，G‐Rg1大劑量組大鼠坐骨神經MNCV和SNCV高于G‐Rg1小劑量組（P＜0.05），表現出劑量依賴性。

2.2 G‐Rg1保護糖尿病大鼠坐骨神經超微結構變化圖1顯示，透射電鏡觀察坐骨神經超微結構變化如下：正常對照組大鼠坐骨神經有髓神經纖維和無髓神經纖維結構完整，髓鞘質膜電子密度均勻，呈同心圓狀排列整齊，層次明顯，線粒體結構完整，可見微管和微絲分布均勻。模型組大鼠坐骨神經有髓神經纖維明顯變性，多處可見空泡狀變性，神經纖維多處有質膜分離形成裂隙或扭曲，電子密度不均勻，軸索腫脹或變形；無髓神經纖維的線粒體破壞，微管和微絲結構不均勻；G‐Rg1小劑量組大鼠坐骨神經有髓神經纖維和無髓神經纖維髓鞘結構有輕微髓鞘脫離，質膜層次明顯，電子密度比較均勻；G‐Rg1大劑量組大鼠坐骨神經有髓神經纖維和無髓神經纖維髓鞘結構完整，無板層分離現象，未見空泡變性，線粒體無腫脹，嵴未見斷裂，微管、微絲分布均勻，電子密度一致。

圖1 G‐Rg1改善糖尿病大鼠坐骨神經超微結構變化（電鏡，×4 000）Fig.1 Improvement of ultrastructural changes in sciatic nerve by G‐Rg1（electron microscopy，×4 000）

圖2 G‐Rg1減 少 糖 尿 病 大 鼠 坐 骨 神 經TNF‐α和IL‐6 mRNA表達Fig.2 G‐Rg1 decreased TNF‐α and IL‐6 mRNA expres-sions in sciatic nerve tissues in diabetic rats

表1 G‐Rg1對糖尿病大鼠空腹血糖及坐骨神經MNCV和SNCV的改善作用（±s，n=10）Tab.1 Therapeutic effects of G‐Rg1 on fasting blood glu-cose levels，MNCV and SNCV in diabetic rats（±s，n=10）

表1 G‐Rg1對糖尿病大鼠空腹血糖及坐骨神經MNCV和SNCV的改善作用（±s，n=10）Tab.1 Therapeutic effects of G‐Rg1 on fasting blood glu-cose levels，MNCV and SNCV in diabetic rats（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs Control group；2）P＜0.05 vs Model group；3）P＜0.05 vs Low G‐Rg1 group.

SNCV（m/s）38.89±4.22 18.58±3.651）23.97±3.292）28.65±4.582）3）24.36±3.772）Treatment Control Model Low G‐Rg1 High G‐Rg1 Metformin FBG（mmol/L）5.68±1.04 21.05±5.141）17.98±4.08 12.89±2.472）3）11.65±2.852）MNCV（m/s）40.56±4.88 25.34±3.141）30.97±5.292）38.38±6.482）3）33.48±5.092）

圖3 G‐Rg1改善糖尿病大鼠Nrf2、HO‐1和NF‐κB總蛋白表達Fig.3 Improvement of the protein expressions of Nrf2，HO‐1 and NF‐κB in the sciatic nerve by G‐Rg1

表2 G‐Rg1降低糖尿病大鼠坐骨神經MDA和ROS以及血清TNF‐α和IL‐6的水平（±s，n=10）Tab.2 G‐Rg1 reduced levels of MDA and ROS of sciatic nerve tissues and concentrations of TNF‐α and IL‐6 of serumin di-abetic rats（±s，n=10）

表2 G‐Rg1降低糖尿病大鼠坐骨神經MDA和ROS以及血清TNF‐α和IL‐6的水平（±s，n=10）Tab.2 G‐Rg1 reduced levels of MDA and ROS of sciatic nerve tissues and concentrations of TNF‐α and IL‐6 of serumin di-abetic rats（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs Control group；2）P＜0.05 vs Model group；3）P＜0.05 vs Low G‐Rg1 group.

IL‐6（pg/ml）35.47±4.15 78.91±8.251）69.87±8.112）40.62±5.122）3）48.66±5.732）Treatment Control Model Low G‐Rg1 High G‐Rg1 Metformin MDA（nmol/L）5.28±0.98 10.23±1.251）8.26±1.622）6.88±1.332）3）8.84±1.962）ROS（U/mg prot）108.64±12.85 242.64±32.661）206.87±30.262）139.77±11.422）3）213.75±25.672）TNF‐α（pg/ml）43.26±5.15 88.35±9.141）79.72±8.832）48.37±5.082）3）58.78±6.332）

2.3 G‐Rg1降低糖尿病大鼠坐骨神經MDA和ROS以及血清中TNF‐α和ⅠL‐6水平由表2可知，模型組大鼠坐骨神經組織MDA和ROS水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；G‐Rg1小劑量和大劑量組大鼠坐骨神經組織中MDA和ROS水平明顯受到抑制（P＜0.05）；G‐Rg1大劑量組MDA和ROS水平低于G‐Rg1小劑量組（P＜0.05），表現出劑量依賴性。ELISA檢測各組大鼠血清中TNF‐α和IL‐6的變化如下：與正常對照組相比，模型組大鼠血清中TNF‐α和IL‐6水平明顯升高（P＜0.05）；G‐Rg1小劑量和G‐Rg1大劑量組大鼠血清中TNF‐α和IL‐6水平比模型組顯著降低（P＜0.05）；G‐Rg1大劑量組血清中TNF‐α和IL‐6明顯低于G‐Rg1小劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

2.4 G‐Rg1減少糖尿病大鼠坐骨神經TNF‐α和ⅠL‐6 mRNA表達與正常對照組相比，模型組大鼠坐骨神經TNF‐α和IL‐6 mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；G‐Rg1小劑量和G‐Rg1大劑量組大鼠坐骨神經TNF‐α和IL‐6 mRNA比模型組降低，差異有統計學意義（P＜0.05，圖2）。

2.5 G‐Rg1改善糖尿病大鼠坐骨神經Nrf2、HO‐1和NF‐κB總蛋白表達由圖3可知，模型組Nrf2和HO‐1表達明顯低于正常對照組（P＜0.05）；與模型組相比，G‐Rg1小劑量和G‐Rg1大 劑 量 組Nrf2和HO‐1表達增高（P＜0.05）；G‐Rg1大劑量組大鼠坐骨神經Nrf2和HO‐1比G‐Rg1小劑量組明顯增多（P＜0.05），顯示出劑量依賴性。模型組NF‐κB表達明顯高于正常對照組（P＜0.05）；與模型組相比，G‐Rg1小劑量和G‐Rg1大劑量組NF‐κB表達明顯受到抑制（P＜0.05）。

3 討論

DPN是糖尿病患者常見的晚期并發癥之一，發病率高，但臨床上還沒有療效顯著的藥物。因此，目前對DPN發病機制及其治療的研究是眾多學者關注的熱點問題［8‐9］。本研究利用STZ制作糖尿病大鼠模型，隨著病程延長達到造模后8周時，模型組大鼠坐骨神經MNCV和SNCV明顯減慢，符合DPN神經損傷的功能指標。同時利用電鏡觀察，可見DPN大鼠坐骨神經多處有明顯的超微結構變化。這些功能與形態學的變化類似于人的DPN發病過程。

本研究發現G‐Rg1小劑量和大劑量治療對DPN大鼠坐骨神經有明顯的保護作用。已有文獻報道G‐Rg1可有效降低糖尿病大鼠血糖水平，升高胰島素和C肽，抑制體內氧化應激反應，調節糖代謝作用［10‐11］。本研究發現，G‐Rg1干預后，G‐Rg1大劑量組大鼠空腹血糖比模型組明顯降低；小劑量組降血糖效果不明顯，但仍然對DPN有療效。因此認為G‐Rg1對神經組織的營養與保護作用不僅源于其降血糖作用，也源于其對神經組織的直接作用。

DPN的發生與多種機制相關，如非酶促蛋白糖基化、氧化應激、神經營養因子缺乏和炎癥級聯反應通路的激活等，其中氧化應激為其最重要、最普遍的機制之一。長期的高血糖誘導氧化應激狀態，體內產生過多的ROS，使機體對抗氧化功能的負荷過重，最終導致體內氧化與抗氧化調節失衡，從而影響神經細胞功能，引起神經組織損傷。在此過程中，最受關注的是Nrf2和NF‐kB信號通路相關基因的表達［12‐14］。Nrf2和NF‐kB通路是體內調節氧化應激反應和炎癥反應，維持細胞內環境穩態的關鍵途徑。Nrf2是新型核轉錄因子，是CNC亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族成員，在代謝活躍的器官中高表達，是調控氧化與抗氧化系統的主要調節因子，維持氧化還原的相對平衡。其主要機制為正常情況下，Nrf2與細胞內的伴侶蛋白Kelch‐like ECH相關蛋白1（Ke-ap1）結合抑制其激活，但處于氧化應激狀態時，在ROS的作用下Keap1與Nrf2分離，使Nrf2迅速進入核內，啟動下游基因的轉錄［15］。尤其是在核內與特異性作用元件ARE結合，上調HO‐1表達，發揮細胞的自我防御功能。因為HO‐1具有較強抗氧化活性的同時也參與抗炎癥因子的表達并調節各種免疫應答，抑制細胞凋亡等功能。多數研究報道，氧化應激狀態下，組織中Nrf2和HO‐1表達明顯受到抑制，因此提出上調Nrf2和HO‐1的表達作為DPN治療的新靶點［16‐17］。本 研究 發現，DPN大 鼠 血清 中ROS和MDA水平升高，可以判斷處于氧化應激狀態，同時坐骨神經Nrf2與HO‐1表達明顯降低，符合氧化與抗氧化失衡導致細胞自我保護機制破壞造成組織損傷的理論。NF‐κB是一種核轉錄因子，參與細胞的增殖分化及免疫應答相關的信號通路，對啟動細胞內炎癥因子表達起重要作用［18］。在正常生理活動時，NF‐κB與IκB在細胞質內結合形成多聚體，表現為無活性的NF‐κB。在DPN的發病過程中，高血糖導致細胞處于氧化應激狀態，細胞內堆積的ROS和其他細胞因子可激活IκB激酶（IKK），使之發生磷酸化導致其與NF‐κB解離，游離的NF‐κB進入細胞核內啟動炎癥因子TNF‐α和IL‐6等的表達［19］。TNF‐α是炎癥反應中重要的炎癥介質之一，能激活各種炎癥細胞增加血管內皮細胞通透性，促使其他細胞因子的合成與釋放。IL‐6能誘導B細胞分化并產生抗體，促進T細胞活化增殖，參與機體免疫應答，介導并加快炎癥反應進程。長期的高糖環境下，TNF‐α和IL‐6同時參與胰島素抵抗和炎癥反應會導致內皮細胞功能障礙和微血管病變引起神經損傷從而加快DPN發生。多數學者認為，破壞NF‐κB與其他各種核轉錄因子的相對穩定和動態平衡會導致神經組織損傷［9，14］。本研究發現，DPN大鼠坐骨神經NF‐κB表達明顯增高，血清和坐骨神中的TNF‐α和IL‐6水平也增高，提示NF‐κB通路的激活誘導炎癥因子表達，不管在全身還是局部組織的炎癥均在DPN的病程中發揮作用，促進神經損傷。

中醫學認為，DPN是因消渴日久，氣陰兩虛，陰陽氣血虧虛，血行不暢，筋脈肌肉失養所致。二甲雙胍為2型糖尿病臨床治療的常用藥物，具有降糖效果和抗炎作用，且具有價格低廉、治療效果明確等優點。但根據DPN發病機制的特點，治療上提出以益氣養陰和溫陽通絡為原則，利用中藥藥理作用多途徑、多靶點、多系統的優勢，開發多種中醫藥復方解決治療DPN的難點［20］。人參作為藥中之王，是常用的名貴中藥材，具有補氣固脫、寧心益智、養血生津、補脾益肺和大補元氣之功效，能夠調節中樞神經系統、改善心肌功能、增加機體免疫功能、調節血糖、抗腫瘤、抗氧化等。目前已經從人參中分離出40余種具有藥理活性的單體成分，如人參皂苷Rg1、Rg3、Rb1、Re等。其中人參皂苷Rg1是應用最為廣泛的單體成分，其對神經組織的調理和營養作用備受關注［21‐22］。因此，本實驗觀察到G‐Rg1大、小劑量組大鼠坐骨神經傳導速度比模型組明顯增高，同時電鏡觀察坐骨神經超微結構形態學變化明顯改善，提示G‐Rg1對神經組織具有良好的營養作用，可促進周圍神經組織再生，逐漸修復損傷的神經。為進一步證實G‐Rg1對坐骨神經的保護機制，本研究發現，G‐Rg1連續干預8周后，G‐Rg1治療組大鼠坐骨神經組織和血清中MDA、ROS水平明顯受到抑制，提示G‐Rg1可有效清除體內堆積的MDA和ROS，對坐骨神經組織的氧化應激有較好的改善作用，緩解氧化應激對神經的損傷，防止DPN進一步加重。同時G‐Rg1干預后，治療組大鼠坐骨神經組織中Nrf2和HO‐1表達增多，而NF‐κB表達明顯抑制而減少體內促炎因子TNF‐α和IL‐6表達。通過以上實驗結果可以推測，G‐Rg1對DPN大鼠周圍神經具有明顯的保護作用和營養作用，主要表現在以氧化應激和炎癥反應為主的DPN的發病機制中，通過氧化與抗氧化、炎癥因子表達通路中Nrf2、HO‐1及NF‐κB的相互調節，能夠發揮維持細胞內環境穩態，改善氧化應激狀態，減少細胞炎癥從而保護神經的作用。團隊后期實驗將進一步明確G‐Rg1的藥理作用及其相關的信號通路，為DPN治療藥物的開發提供更加可靠而準確的基礎實驗依據。