巨噬細胞起源、活化和功能異質性在放射性肺損傷中的作用研究進展①

張妮 楊揆 白健 秦鴻雁

（空軍軍醫大學基礎醫學院醫學遺傳與發育生物學教研室，西安710032）

放療是治療肺癌、食管癌、乳腺癌等胸部腫瘤的有效手段之一。放射性肺損傷（radiation-induced lung injury，RILI）是胸部腫瘤放射治療過程中最常見的并發癥，包括早期的放射性肺炎（radiation pneumonitis，RP）和晚期的放射性肺纖維化（radia?tion-induced lung fibrosis，RILF）兩個階段［1-2］。暴露于電離輻射下的肺組織不僅出現DNA損傷，且受損的肺泡上皮細胞可釋放大量炎癥因子導致肺臟組織微環境改變，進一步引發肺部炎癥和肺纖維化。其中，炎癥細胞，尤其是單核-巨噬細胞在肺組織炎癥反應起始階段到纖維化重塑階段均發揮重要調控作用［3-5］。近期利用細胞命運示蹤技術結合動物損傷模型研究發現，巨噬細胞是一群具有起源、活化和功能高度異質性的固有免疫細胞。在肺臟中存在幾種不同的巨噬細胞亞群：有駐留在肺泡和間質的巨噬細胞，也有在損傷后由血液單核細胞遷移至肺臟分化而成的巨噬細胞［6］。此外，在不同的微環境因子刺激下，巨噬細胞表現出不同的活化模式，并呈現出不同的功能。如經典活化的M1型巨噬細胞發揮促炎和抗纖維化作用，而替代活化的M2型巨噬細胞則發揮抗炎和促纖維化作用［7］。

1 巨噬細胞起源異質性與RILI

長期以來人們認為組織定居巨噬細胞都是由骨髓來源的單核細胞分化而來。但近期利用細胞命運示蹤小鼠的研究發現，巨噬細胞是一群具有起源異質性的固有免疫細胞。除小腸、皮膚巨噬細胞自成體后來源于骨髓造血單核細胞外，絕大多數的組織定居巨噬細胞并非來源于成體后骨髓單核細胞，而是來源于胚胎時期的卵黃囊和/或胎肝，并持續至個體發育成熟［8-9］。如腦的小膠質細胞起源于卵黃囊紅系-巨噬前體細胞，皮膚朗格漢氏和肝臟庫普弗細胞起源于卵黃囊和胎肝造血干細胞，肺泡巨噬細胞、腹腔巨噬細胞和脾臟紅髓巨噬細胞起源于胚胎造血干細胞。這些組織定居巨噬細胞在靜息或炎癥狀態下可進行原位增殖和自我更新，其不依賴或部分依賴于骨髓來源的巨噬細胞貢獻［10-11］。

靜息態下的肺臟巨噬細胞由分布于肺泡腔的肺泡巨噬細胞（alveolar macrophages，AMs，siglecF+CD11b-F4/80+CD11c+）和分布于間質的肺間質巨噬細胞（interstitial macrophages，IMs，siglec-CD11b+F4/80+CD11c-）組成［12］。其中，組織定居的AMs起源于胚胎時期的卵黃囊階段，具有自我更新能力，占肺臟巨噬細胞的75%，在維持免疫耐受中發揮重要作用［13-14］。而IMs既起源于卵黃囊期也起源于骨髓單核細胞，其更新依賴于骨髓單核細胞，構成近9%的脈管外髓系細胞，具有吞噬和清除進入肺間質異物的能力［15-17］。在炎癥包括放射誘導的肺損傷情況下，肺臟巨噬細胞除了由AMs和IMs組成外，還包括在損傷后由血液單核細胞遷移至肺臟分化而成的巨噬細胞［6］。RILI后AMs和IMs處于動態變化中。在接受輻照15 d后，AMs的數目降到最低，直到16周，AMs細胞水平再次上升。而位于肺間質的IMs在輻照后第6天達到峰值，隨后下降至穩定水平，直到輻照16周后，IMs細胞數目再次上升。在輻射15 d后，AMs大量死亡耗盡，而IMs不僅沒有減少，其數量還有增加，表明IMs可能比AMs具有更強的抗輻射能力或者骨髓的單核細胞替代補充更加迅速［18-21］。而且大量研究表明這些炎性巨噬細胞可以轉換成IMs和AMs進而發揮調控作用［4，22-23］。然而，這些不同起源的肺臟巨噬細胞是通過何種機制參與RILI與RILF的過程，尚有待進一步研究。

2 巨噬細胞活化模式與RILI

研究表明，巨噬細胞是一類可塑性強，免疫功能多樣的細胞亞群。在不同的微環境、不同的刺激因子下表現為不同的活化狀態［24-25］。即經典激活的M1型巨噬細胞和替代活化的M2型巨噬細胞。而M2型的巨噬細胞又依據其誘導分子和功能表型分為抗炎型M2a、免疫調節型M2b和創傷愈合型M2c。M1型巨噬細胞的激活依賴于細菌產物脂多糖（LPS）、IFN-γ或IL-12等刺激，具有清除細菌、釋放促炎因子如IL-12、TNF-α、IL-1β和ROS以及降解細胞外基質等功能；M2型巨噬細胞的激活依賴于IL-4、IL-13和IL-10等刺激，具有抵御寄生蟲感染、促進組織修復和釋放免疫調節因子如IL-10、IL-4、IL-13和TGF-β以及分泌組織抑制因子（TIMP-1）拮抗金屬基質蛋白等功能［26］。然而，來源于體外研究的M1/M2活化模式并不能真實地反映體內觀察到的巨噬細胞表型。近期由于表觀遺傳學、基因表達和功能研究上的技術和分析方法進步，揭示了巨噬細胞的活化狀態是一個超出M1/M2型巨噬細胞活化模式的譜系變化［27］。在不同微環境因子刺激下，巨噬細胞表現出不同的活化模式，并呈現出不同的功能。如經典活化的M1型巨噬細胞發揮促炎和抗纖維化作用，而替代活化的M2型巨噬細胞則發揮抗炎和促纖維化作用［28］。

多項研究結果表明，在RILI的早期RP階段，巨噬細胞主要表現為M1型活化，釋放細胞因子如IL-12，TNF-α、IL-1β和ROS等，以清除病原菌的作用。但在纖維化起始和進展期，巨噬細胞則表現為M2型活化。M2型肺巨噬細胞一方面在肺纖維化起始階段釋放ROS和分泌MMP-10、MMP-13、MMP-28，級聯放大肺泡上皮細胞的損傷，促進Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡［29］；另一方面在肺纖維化進展期，M2型肺巨噬細胞通過釋放促纖維化細胞因子TGF-β和Arg1，作用于肺內的成纖維細胞和周細胞，促進肌成纖維細胞的形成和細胞外基質的沉積，加重肺纖維化［30］。同樣，在肺間質纖維化患者中，M2型巨噬細胞的表面標志物呈現高表達［30-31］。M1巨噬細胞的增多主要發生在放射誘導肺炎癥階段，在進展到肺纖維化階段，巨噬細胞主要為M2型。因而LI等［32］將M2型巨噬細胞回輸給巨噬細胞清除后的經輻照的肺臟組織，則肺纖維化再次重建。而回輸M1型巨噬細胞對肺纖維化沒有影響。提示M2型巨噬細胞在輻照誘導的肺損傷尤其是肺纖維化形成中發揮關鍵調控作用。目前大量臨床肺纖維化患者研究支持了M2型肺泡巨噬細胞在纖維化中的作用［33］。因而，在RILI與RILF中巨噬細胞被分為促炎型和修復型兩種類型，對肺臟的損傷和修復發揮“雙刃劍”作用。然而，在RILI與RILF中調控巨噬細胞M1/M2活化的機制仍有待進一步研究。

3 巨噬細胞活化和功能調控與RILI

機體可以通過多種機制參與巨噬細胞活化和功能的調控，如以細胞因子介導的信號途徑（IL-4、IL-13等）、胞內信號途徑（JAK-STAT、NF-κB和Notch信號等）、轉錄因子（PPAR-γ、KLF4、IRF5和HIF-1α）介導以及一些表觀遺傳修飾等機制［33-34］。IL-13和IL-4分別與巨噬細胞膜表面的受體IL-13R和IL-4R結合，激活下游經典的JAK-STAT6信號通路，促進巨噬細胞向M2型活化，發揮抗炎和促修復作用［35］。HE等［36-37］利用Cu，Zn-SOD-/-小鼠研究肺纖維化時發現，在野生小鼠中線粒體Cu，Zn-SOD介導的H2O2大量產生誘發DNA受損，進而增強STAT6轉錄，促使巨噬細胞向M2型極化而導致肺纖維化。之后利用Cu，Zn-SOD轉基因小鼠進一步證明了此現象。提示Cu，Zn-SOD通過STAT6調控巨噬細胞M2型極化而參與肺纖維的進展。近期，TAO等［38］利用博來霉素結合髓系Shp2條件性剔除小鼠建立肺纖維化模型發現，Shp2缺失導致IL-4介導的JAK1/STAT6信號活化進而誘導M2型巨噬細胞活化而加重肺纖維化。而ARRAS等［39］在二氧化硅顆粒誘導的小鼠肺纖維化模型中發現，IL-9通過抑制M2巨噬細胞極化而發揮抗纖維化作用。長期慢性過表達IL-10的小鼠同樣通過促進M2型巨噬細胞極化和誘導CCR2-CCL2的表達而自發肺纖維化［40］。ZHAO等［41］研究同樣表明在放療誘導的肺纖維化中galec?tin-3的高表達與M2型巨噬細胞呈正相關。敲低巨噬細胞系galectin-3可降低M2巨噬細胞標志物YM1的表達。這些數據均提示，細胞因子信號誘導的M2型巨噬細胞在不同因素誘導的肺纖維化進展中發揮重要的調控作用。

4 以巨噬細胞為靶點的抗纖維化治療的前景

目前，激素和抗生素的常規治療雖然能在一定程度上改善患者癥狀，但不良反應較多，且對已進展到肺纖維化的患者療效甚微，因此，積極探尋新的治療策略對RILI具有重要意義。巨噬細胞可產生大量抗氧化分子，如錳超氧化物歧化酶（Mn?SOD），超氧離子（O2-）等，是人類細胞中抵御輻射能力較強的細胞之一［41］。因此，針對巨噬細胞進行預防或治療RILI成為一種新的治療策略。有研究者利用集落刺激因子1受體（colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R）的單克隆抗體特異性清除IM，可防治RILF［18，21］。抑制CCL2/CCR2信號軸，可阻止單核細胞遷移進入受輻照部位的肺組織，減輕肺纖維化［42］。因此，減少損傷肺組織中促進纖維化的M2型巨噬細胞可以作為預防和治療RILI的潛在靶點。另一種治療策略是將巨噬細胞重編程和免疫系統再教育，使巨噬細胞發揮抗纖維化的“好”的作用，從而減輕RILI。在腫瘤模型中，使用低劑量放射線可使巨噬細胞再教育為具有抗腫瘤作用的“好”的巨噬細胞［43］。在RILI中，也可通過將促纖維化的M2型巨噬細胞教育為“好”抗纖維化的M1巨噬細胞，從而防治放射性肺損傷［18］。因此，精準監測和調控放射誘導的肺臟巨噬細胞的活化表型可能是防治RILI與RILF的新策略。

近期，本課題組利用巨噬細胞特異剔除Notch信號途徑關鍵轉錄因子RBP-J的小鼠建立博來霉素誘導的肺纖維化模型，進行組織Masson和天狼猩紅染色發現：在肺纖維化模型中，敲除RBP-J的小鼠間質纖維化程度減輕。同時Notch信號減少了促纖維化的骨髓單核來源的肺泡巨噬細胞（MO-AMs）的募集和TGF-β的分泌，減輕小鼠肺纖維化。這些研究提示，靶向巨噬細胞的Notch信號可能是治療肺纖維化的新靶點。骨髓來源的巨噬細胞募集到受損傷的組織主要依靠CCR2-CCL2分子信號軸，抑制CCR2-CCL2的信號軸可有效減輕小鼠博來霉素和RILI誘導的肺纖維化［42］。但抗CCL2的2期臨床試驗現已經提前終止，原因是患者預后沒有明顯改變，并出乎意料地導致其CCL2水平升高［44］。靶向受體CCR2減輕肺纖維化還未見相關報道。但有一個CCR2/CCR5雙重拮抗劑目前正處于肝纖維化的臨床試驗階段［45］。另外，IMs是輻射誘發的肺纖維化的主要驅動因素，IMs高表達CSF1R，因此CSF1R是治療肺纖維化的潛在靶點。由于腫瘤相關巨噬細胞也高表達CSF1R，CSF1R的抑制劑正在進行腫瘤患者的臨床試驗［46］，從而預估其在肺纖維化中治療中的作用。因此，盡管巨噬細胞在肺纖維化的發生發展中起重要作用，但由于其起源和功能的異質性，仍然需要更多、更深入的研究，這對于優化以巨噬細胞為靶點的抗纖維化干預措施具有重要意義。

放療是治療腫瘤的重要措施，通過聯合其他治療方法可提高腫瘤患者的生存期。RILI是其嚴重的并發癥，更直接威脅腫瘤患者的生存質量，從而抵消放療帶來的益處，嚴重者甚至危及生命。揭示不同起源、活化模式和功能異質性的巨噬細胞在RILI與RILF中的作用及調控機制有望為肺纖維化的治療提供新策略和新思路。