內質網-線粒體接觸與抗病毒免疫應答①

沈娛汀 李 娟 宋 云 方 亮 陳麗華（空軍軍醫大學基礎醫學院免疫學教研室，西安710032）

內質網是細胞質中一個與細胞基質相隔離，但彼此相通的囊腔和細管系統。早在1945年，PORTER等用電鏡觀察小鼠成纖維細胞時發現了細胞中的分支相互連通的立體網狀結構，稱之為內質網。根據內質網膜上是否附著核糖體，可將其分為粗面內質網和滑面內質網。粗面內質網上附著有大量核糖體，為蛋白質和多肽鏈的加工合成提供場所；而滑面內質網膜上無核糖體附著，無法合成蛋白質，但與糖類、脂質的合成作用有關，并參與脂質的運輸［1］。線粒體是真核細胞有氧呼吸的主要場所，參與能量轉化、三羧酸循環和氧化磷酸化等反應。同時，線粒體可以儲存由內質網轉運過來的Ca2+，從而控制細胞中的鈣穩態。透過電子顯微鏡觀察到，內質網與線粒體之間的距離十分微小，滑面內質網與線粒體外膜之間的距離為10 nm，粗面內質網與線粒體外膜之間的距離為25 nm［2］。人們將內質網與線粒體之間的結構域稱之為內質網-線粒體接觸，其在調節細胞Ca2+穩態、磷脂合成、細胞凋亡、線粒體動力學以及內質網應激等方面均發揮著重要的作用［3-4］。除此之外，越來越多的蛋白質被證明參與內質網-線粒體接觸，提示敲除或誘導這些蛋白的表達可能會影響細胞的一系列生物學功能［5］。本文將對內質網-線粒體接觸方式以及此結構調控抗病毒反應的相關性研究進行綜述，以期為抗病毒治療提供新的靶點與方向。

1 內質網-線粒體接觸

內質網-線粒體接觸是線粒體外膜與內質網膜之間相互接近并且相互作用的結構域，在多種生理過程中發揮著重要作用。目前，人們發現內質網與線粒體之間并不是直接相互接觸的，而是需要通過許多蛋白或蛋白質之間的相互作用來實現，包括：線粒體融合蛋白2（mitofusin2，Mfn2）、三磷酸肌醇受體（inositol triphosphate receptors，IP3R）與電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channels，VDAC）之間相互作用、囊泡相關膜蛋白相關蛋白B（vesicle-associated membrane protein-associated protein B，VAPB）與蛋白酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51（protein tyrosine phosphatase interacting protein-51，PTPIP51）相互接觸以及B細胞受體相關蛋白31（B-cell receptor-associated protein 31，Bap31）與線粒體裂變蛋白1（Fission 1 homologue，Fis）之間的相互作用等。

1.1 Mfn2在內質網-線粒體接觸中的作用 在哺乳動物細胞中，Mfn2存在于線粒體外膜和內質網表面。通過共聚焦顯微鏡，研究者觀察到Mfn2水平降低時，內質網與線粒體之間的距離相應增加［6］。但FILADI等［7］通過透射電子顯微鏡發現，在Mfn2-∕-小鼠的胚胎成纖維細胞中，內質網-線粒體接觸的數目多于野生型（wide type，WT）小鼠，當敲除WT小鼠的Mfn2后，內質網-線粒體接觸數目增加，同時Ca2+從內質網向線粒體的轉運增強［8］。作者認為，造成這兩種相反結果的原因可能是透射電子顯微鏡評估的是細胞器之間接觸的數量和大小，而熒光顯微鏡通常測量的是內質網與線粒體的重疊面積或體積。當Mfn2敲除后，線粒體腫脹碎裂，形態發生明顯改變，并且所占細胞面積減少，因此通過熒光顯微鏡容易觀察到內質網與線粒體接觸水平降低。事實上，內質網-線粒體的接觸數量不但沒有減少，反而呈增高趨勢。

1.2 IP3R-VDAC與Ca2+轉運IP3R是位于內質網膜上的三磷酸肌醇依賴性鈣通道，當細胞外可溶性激動劑與G偶聯蛋白受體結合時，磷脂酶Cβ（phospholipase Cβ，PLC）被激活，由磷脂酰肌醇4，5二磷酸（phosphatidylinositol 4，5 bisphosphate，PIP2）水解產生肌醇-1，4，5-三磷酸（inositol-1，4，5-trisphosphate，IP3）［5］。IP3與其在內質網上的受體結合并誘導其開放，從而介導內質網中Ca2+的釋放［9］。VDAC是一個廣泛存在于線粒體外膜的分子，高等多細胞生物和哺乳動物具有三種不同類型的VDAC（VDAC1、VDAC2、VDAC3），其中VDAC1最具有代表性。研究表明，IP3R與VDAC并非直接接觸，而是需要通過位于線粒體基質中的葡萄糖調節蛋白75（Glucose regulated protein 75，Grp75）連接促進內質網-線粒體相互作用［10］。

細胞質、內質網和線粒體中Ca2+濃度分別約為100 nmol∕L、1 000 μmol∕L和1 000 nmol∕L，線粒體鈣單向轉運蛋白（mitochondrial calcium uniporter，MCU）是一種位于線粒體內膜上的高選擇性離子通道，介導Ca2+通過MCU穿過線粒體內膜進入線粒體。因此，IP3R-Grp75-VDAC-MCU鈣調節軸在維持細胞內Ca2+穩態中發揮重要作用［10］。

最近，BARTOK等［11］研究發現IP3R1大部分粘附在細胞表面，而IP3R2和IP3R3在細胞中的分布更加均勻，不同亞型的IP3R對于Ca2+從內質網到線粒體的轉運速率不同（IP3R2＞IP3R3＞IP3R1）。同時，IP3R2與IP3R3在細胞中的主要作用是促進Ca2+從內質網到線粒體的快速轉運，IP3R1的主要作用是維持Ca2+在內質網與線粒體之間的轉運。然而值得注意的是，無論是在內質網和線粒體之間形成緊密相互作用方面，還是在調節細胞器的亞細胞分布方面，IP3R的作用均不依賴于Ca2+的轉運。

1.3 VAPB-PTPIP51調控內質網-線粒體接觸 內質網蛋白VAPB與線粒體蛋白PTPIP51的接觸在內質網與線粒體的相互作用中同樣發揮重要作用。通過透射電子顯微鏡觀察到，過表達的VAPB或PTPIP51可使內質網與線粒體接觸更加緊密；而當用siRNA敲除VAPB或PTPIP51時，接觸變得更 加 松弛，并促進自噬體的形成［12］。同時，人工連接內質網和線粒體降低了自噬體水平，說明VAPB-PTPIP51對自噬體形成的調節是通過調控內質網-線粒體接觸來完成的［13］。

VAPB-PTPIP51間相互作用還可以調節Ca2+從內質網向線粒體的釋放［14］；過表達或siRNA敲除VAPB和PTPIP51影響內質網-線粒體接觸導致IP3R與VDAC之間的相互作用發生改變，進而影響IP3R依賴的線粒體對Ca2+的吸收。有趣的是，這些變化并不涉及IP3R、VDAC以及MCU表達水平的改變。同時，當阻斷IP3R介導的Ca2+從內質網向線粒體轉運時，VAPB-PTPIP51過表達對自噬體形成的抑制作用被完全消除［13］。

PTPIP51除了能與VAPB相互作用以外，GALM-ES等［15］通過免疫共沉淀實驗證明，在內質網上，氧化固醇結合蛋白家族（oxysterol-binding protein（OSBP）-related proteins，ORPs）ORP5∕8通 過 其ORD結構域中的磷脂轉移同樣可以與PTPIP51結合，在維持線粒體形態與呼吸方面發揮重要作用，但其具體機制還不清楚。

1.4 Bap31-Fis與細胞凋亡 凋亡誘導因子刺激時，多功能分選蛋白2（multifunctional sorting protein 2，PACS-2）與去磷酸化的BH3結構域凋亡蛋白（BH3 interacting death agonist，Bid）結合，并將其運輸至線粒體中。Bid蛋白最終被切割成為截短型Bid片段（truncated Bid，tBid），從而導致細胞色素C的釋放，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，caspase-3）的激活和細胞凋亡［16］。但如何將凋亡信號逆向從線粒體傳入內質網，作者并未在文中闡明。IWASAWA等［17］在用Fis轉染HeLa細胞以及在用siRNA敲除廣泛表達于內質網的Bap31時發現，Bap31中的死亡效應域的變異為procaspase-8的活化提供平臺。Fis與Bap31相互作用，通過procaspase-8促進其分裂為促凋亡的P20Bap31，從而將凋亡信號從線粒體傳遞至內質網。

1.5 其他蛋白對于內質網-線粒體接觸的影響 隨著對內質網-線粒體接觸的深入研究，越來越多的蛋白或蛋白之間的相互作用被證明參與調節內質網-線粒體接觸，進而調控機體的代謝等生理反應。如：內質網-線粒體接觸位點上的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白2（mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）以及糖 原 合 酶 激 酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）的亞細胞分布促進己糖激酶I（hexokinase I，HK-I）向VDAC的募集，進而支持記憶CD8+T細胞快速獲得發揮其效應功能所需的代謝能量［18］；FUN14相 關 蛋 白1（FUN14 domain containing 1，Fundc1）定位于內質網-線粒體接觸部位，與IP3R2結合介導IP3Rs依賴的Ca2+從內質網向線粒體或肌漿的釋放。Fundc1缺陷細胞內Ca2+水平降低抑制Fis表達，進而破壞線粒體分裂，導致線粒體功能障礙［19-20］；內質網伴侶蛋白Sigma-1同樣定位于內質網-線粒體接觸部位，與另一內質網伴侶蛋白Bip結合。當內質網管腔Ca2+濃度降低導致IP3Rs開放后，Sigma-1和Bip解離并與IP3R3結合，從而減少Ca2+轉移并防止蛋白酶體降解［9］。

2 內質網-線粒體接觸與抗病毒免疫應答

病毒是由核酸和蛋白質外殼構成的介于生命和非生命之間的一種物質，需要依賴寄生于細胞中存活。病毒處于細胞外環境時，其復制并不活躍，但具有感染細胞的能力。當病毒進入細胞后，則解體釋放核酸分子，借助細胞內的物質進行自我復制。同時，為了抵抗和消除病毒的感染和破壞，機體將啟動抗病毒免疫應答。研究表明，內質網-線粒體接觸參與調節機體的抗病毒免疫應答過程。

2.1 內質網-線粒體接觸與抗RNA病毒免疫應答RNA病毒是一種以核糖核酸為遺傳物質的病毒，包括大部分植物病毒（如煙草花葉病毒）和少量動物病毒（如HIV）。與DNA病毒相比，RNA病毒更加容易致病及突變，因此種類更多，難以研制有效疫苗。固有免疫應答是機體在發育和進化過程中形成的天然免疫防御措施，當宿主細胞受到病毒的攻擊時，細胞內的模式識別受體（pathogen recognition receptors，PRRs）識別病毒的病原相關分子模式（pathogen associated-molecular patterns，PAMPs）從而啟動固有免疫應答。細胞中經典的PRRs分為Toll樣受體、核苷酸結合寡聚化結構域（NOD）樣受體家族（NLRs）以及視黃酸誘導基因Ⅰ（RIG-1）樣受體（RLRs）。研究表明RLRs主要在細胞質中與病毒RNA結合［21］，包括了RIG-1和黑色素瘤分化相關基因5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA-5）。當RNA病毒感染時，RIG-1和MDA-5中的兩個Caspase募集結構域（caspase recruitment domains，CARDs）與線粒體抗病毒信號蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）的CARDs結構域相互作用，在K63多泛素鏈存在的情況下將內源性MAVS轉化為有功能的MAVS信號復合體，MAVS復合體募集TRADD、FADD、Ripk-1、cFLIPL和Caspase-8等多種信號分子，從而激活起始κB激酶（IKK）相關的TANK結合酶1（TBK1）［21-23］。IKK激活NFκB促進促炎因子的形成，TBK1誘導干擾素調節因子3∕7（interferon regulatory factor，IRF3∕7）磷酸化進而激活Ⅰ型干擾素（interferon，IFN），兩者均可抑制病毒的復制及組裝［24］。

2.1.1 Mfn2與MAVS調節抗病毒免疫應答MAVS定位于線粒體外膜，但也存在于過氧化物酶體和內質網-線粒體接觸部位，可以協助宿主對RNA病毒感染產生固有免疫應答［25］。免疫共沉淀結果表明，Mfn2和MAVS的相互作用取決于MAVS在線粒體上的定位，其主要發生在Mfn2的中央疏水七肽重復序列（HR1）和MAVS的C-端區域之間［26］。過度表達 的Mfn2抑 制RIG-1、MDA-5以 及MAVS介 導 的IRF3和NF-κB的活化；敲除Mfn2可以增加病毒誘導的IFN-β的產生，從而減少病毒復制［27］。但是，調節內質網-線粒體接觸，通過改變Mfn2的定位是否可以影響抗病毒應答現在還不清楚。

2.1.2 其他蛋白與抗病毒免疫應答 香葉酰香葉?；堑鞍踪|翻譯后的脂質修飾，其通過Rac1限制MAVS介導的天然抗病毒免疫應答。在香葉酰香葉?；D移酶-I缺陷的小鼠模型中研究發現，位于內質網-線粒體接觸部位上的小G蛋白超家族中的Rac1直 接與MAVS結合，限 制MAVS與E3連接酶Trim31的相互作用，抑制MAVS的激活；同時Rac1與MAVS連接促進caspase-8∕cFLIPL向MAVS的轉運，從而降解泛素化的Ripk-1，終止MAVS介導的抗病毒應答［22］。CHATEL-CHAIX等［28］發現，當登革熱病毒（dengue virus，DENV）感染時，DENV的非結構蛋白NS4B與內質網上的卷曲膜相連，可以拉長線粒體、破壞內質網-線粒體接觸結構域，從而促進DENV復制以及減少RIG-1依賴的干擾素對病毒的免疫應答。

2.2 內質網-線粒體接觸與抗DNA病毒免疫應答DNA病毒是一種以脫氧核糖核酸為遺傳物質的病毒，廣泛存在于人、脊椎動物和昆蟲體內。DNA病毒感染細胞時，主要依賴胞質DNA的信號傳感器環狀GMP-AMP合酶（cyclic guanosine monophosphateadenosine monophosphate（cGAMP）synthase，cGAS）誘導Ⅰ型干擾素對雙鏈DNA及逆轉錄病毒產生應答［29］。cGAS活性位點的重排促進cGAMP的合成，隨后與內質網駐留的接頭蛋白STING結合并伴隨有TBK1的聚集。TBK1磷酸化STING的C末端尾部（CTT）結構域，導致轉錄因子IRF3的磷酸化并易位于細胞核，介導IFN-β的轉錄，產生免疫應答［30］。早期研究表明，STING與MAVS和RIG-1存在相互作用關系［31］，但STING-MAVS的相互接觸在抗病毒免疫應答中的作用并未被闡明。此外，當某些RNA病毒感染時，可以觸發mtDNA釋放到胞漿，mtDNA結合cGAS但其具體機制還不清楚［32］。

3 總結與展望

內質網與線粒體作為細胞中重要的細胞器參與多種代謝調節。隨著顯微技術的發展，人們發現內質網與線粒體之間存在著緊密的接觸，并且這一接觸調控著細胞的多種生命活動，包括：磷脂合成、Ca2+轉運、炎癥反應、內質網應激等。越來越多的蛋白質或蛋白質之間的相互作用被證明參與內質網-線粒體接觸的調節，應用分子生物學手段增加或敲除這些蛋白的表達，內質網-線粒體之間的接觸也相應改變。然而，多數研究僅僅停留在發現這些蛋白可以影響內質網-線粒體接觸，但其在免疫應答中的特定作用仍有待闡明。

在抗病毒免疫應答領域，有關內質網-線粒體接觸在抗雙鏈RNA病毒免疫應答中作用的研究較多，而在抗DNA病毒免疫應答方面的研究相對較少。而DNA病毒廣泛存在于人、脊椎動物、昆蟲以及多種傳代細胞系中，和人類生活密切相關。因此，研究內質網-線粒體接觸對病毒信號傳導以及病毒的復制與組裝是十分必要的，不僅為深入理解病毒感染的機制提供理論和實驗依據，也可以為臨床中抗病毒治療提供新的方向。