關聯分析在水稻產量性狀遺傳研究中的應用

盧鈺霞，張再君，田志宏*

(1.長江大學生命科學學院濕地生態與農業利用教育部工程研究中心 澇漬災害與濕地農業湖北省重點實驗室，湖北 荊州 434025；2.湖北省農業科學院糧食作物研究所 糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064)

水稻是重要的糧食作物之一，是全球約一半人口的主食。為滿足隨人口增長及經濟快速發展帶來的日益增加的糧食需求，迫切需要進一步提高水稻產量。在適宜的生長環境中，水稻產量主要由每穗粒數、粒重和單株有效穗數決定[1-2]。水稻產量性狀高度復雜，由多個子性狀決定。例如，每穗粒數主要由小穗結實率和穗型決定，其中穗型由分枝的數量、長度和小穗密度組成[3]。此外，小穗內的小花數也是影響每穗粒數形成的一個重要因素[3-4]。水稻高產育種時，千粒重是決定產量的三要素之一，主要受粒型影響，粒型又取決于籽粒的長度、寬度及厚度3個子性狀[1]。每株有效穗數則取決于水稻的分蘗勢力[5]。

水稻產量屬于復雜的數量性狀，受多基因協調控制，同時也受環境因素影響[6]。從水稻品種中挖掘與水稻產量或產量相關子性狀的相關基因，了解其遺傳和分子機制，可為水稻產量性狀改良提供新策略。當前，QTL作圖(quantitative trait locus mapping)和關聯作圖(association mapping)是鑒定植物數量性狀相關基因及基因功能表征的有效手段[7-9]。近幾十年來，通過QTL作圖和關聯作圖，已成功鑒定得到許多與水稻重要農藝性狀相關的位點或候選基因[10-12]。其中，關聯作圖又稱關聯分析(association analysis)或連鎖不平衡作圖(linkage disequilibrium mapping，LD mapping)，是基于連鎖不平衡，根據遺傳標記和性狀之間的相關性強度來檢測和定位數量性狀位點的方法。與QTL作圖相比較，關聯作圖具有以下幾個優勢：(1)關聯作圖具有更高的定位分辨率，可達到單基因水平；(2)關聯作圖研究對象一般為自然群體，可減少構建定位群體的時間；(3)關聯作圖可同時對多個等位基因進行分析，增加等位基因數量[13-14]。基于以上優勢及測序成本的降低，關聯分析成了植物遺傳研究的熱點手段之一，并在水稻遺傳研究中發揮了重要作用。

本文主要概述關聯分析的基本原理及分析策略，簡述關聯分析在水稻產量性狀遺傳研究中的進展，并探討關聯分析在水稻高產育種中的應用前景。

1 關聯分析的基本原理

1.1 關聯分析的理論基礎

關聯分析的理論基礎是連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)，連鎖不平衡又稱配子不平衡或配子相不平衡，是指不同基因座等位基因之間非隨機關聯。與連鎖(linkage)不同的是，LD是指群體中等位基因之間的相關性，而連鎖是指基因座通過染色體上的物理連接而產生的相關遺傳[15]。群體內的LD是突變、重組和其他一些因素累積產生的結果，位點間緊密的連鎖可能會導致高程度的LD，同一染色體或者不同染色體的基因座之間均可出現連鎖不平衡狀態[14]。LD在關聯分析中起重要的作用，LD持續的距離將決定用于關聯分析的標記數量和密度[16-17]。

1.2 連鎖不平衡的度量

LD是指2個或2個以上基因座的等位基因的非隨機關聯，統計的是不同位點間等位基因單倍型的實際觀測頻率與期望頻率之間的差值。假如有2個基因座A、B，其等位基因分別為A、a和B、b，構成單倍型有AB、Ab、aB、ab。4個等位基因的頻率分別為PA、Pa、PB、Pb；4種單倍型的頻率表示為PAB、PAb、PaB、Pab。則LD的基本定義式為DAB=AB-PA·PB，其中AB表示單倍型(或配子)AB的實際觀測頻率，PA和PB分別表示等位基因A和B的頻率。D值的取值范圍高度依賴于等位基因頻率，因此，鮮少將D作為LD值的衡量指標。對于雙等位基因和多等位基因數據，有幾種標準化的LD度量方法[18]。其中應用最廣泛的是D′(個體LD值的標準化測量)和r2(雙等位基因的相關系數r)[19]，其中D′是對僅衡量樣本的重組差異，r2則反映了樣本的重組史和突變史[18]。D′和r2的取值范圍均為0～1。當D′，r2=1，表示2位點間完全連鎖；當D′，r2=0時，則表示2位點間處于連鎖平衡狀態[20]。D′，r2取值越大，連鎖不平衡程度越高。當樣本容量較小時，4種低頻多態性等位基因組合概率降低，這將導致高度不穩定的D′值，因此，D′不適用于小樣本容量的研究[21]。r2預示標記與候選的QTL間可能存在的相關性大小，所以在關聯分析中，通常r2是首選的LD衡量指標[15,18]。在鑒定與表型性狀變異顯著相關的SNP或單倍型時，r2是最合適的LD衡量指標[13]。

利用D′衡量群體的LD值，一般以D′=0.5或最大D′和最小D′的中間值來描述LD在染色體上的衰減距離；若以r2衡量群體的LD值，則一般以r2=0.1或r2=0.2來描述LD在染色體上的衰減距離[13,20]。如果LD在很短的距離內衰減，預計映射分辨率較高，但需要大量的標記；相反，如果LD延伸的距離較長，則需要的標記數量相對較少，但映射分辨率較低[13]。有2種常見的方法用于可視化等位基因之間的LD程度：(1)LD衰減散點圖，用于可視化LD隨遺傳或物理距離衰減的速率；(2)LD矩陣，是某基因內或某染色體上多態性位點間LD的線性排列[9,21]。

1.3 連鎖不平衡的影響因素

群體的LD程度受許多遺傳和非遺傳因素影響，如重組、遺傳漂變、選擇和交配模式等[17,22]。突變產生的多態性是LD形成的原因，多態性間的重組會削弱染色體內部的LD程度，而多態性間的自由組合將會打破染色體內部的LD程度[15]。種群交配模式對LD具有很強的影響，其對LD的影響主要取決于群體內等位基因的有效重組率，自交物種個體趨于純和，所以在發生減數分裂時自交物種的有效重組率比異交物種的有效重組率低。因此，與異交物種相較而言，自交物種的LD程度較高，LD衰減速度較異交物種慢。LD也可以在經歷種群大規模減少并伴隨極端遺傳漂變的種群中產生。種群再分及混合(即不同群體的個體間互交而導致種群間基因流動)將導致LD程度增加，但其影響取決于種群數量、種群間的交換率和重組率[22-23]。此外，選擇會導致群體遺傳多樣性降低，從而導致LD增加。

2 關聯分析策略及其在水稻產量性狀遺傳研究中的應用

2.1 關聯分析策略

關聯分析利用自然群體中的祖先重組事件來產生標記-表型關聯[24]。目前關聯分析的應用包括基因組關聯分析(genome wide association，GWAS)和候選基因關聯分析(candidate gene association analysis，CGAS)，GWAS主要用于分析一定密度均勻覆蓋于全基因組的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)和目標性狀之間的相關性，而候選基因測試只對候選基因進行測序，通常用于分析特定基因的突變體，識別有助于作物改良的等位基因[7,25]。兩者都取決于研究群體的大小和LD程度，基于全基因組掃描的關聯分析在中度至重度LD的群體中最有效，而基于候選基因的關聯分析則更適用于低LD群體[24]。

2.2 GWAS及其在水稻產量性狀遺傳研究中的應用

基于LD的GWAS技術是近年來挖掘植物復雜性狀基因或數量性狀位點的一種有效方法[26]，能夠最大限度地利用自然群體中不相關個體的遺傳變異來獲取更多與相關表型顯著關聯的位點，而不需要額外構建定位群體[12]。水稻GWAS中關聯顯著性閾值的確定至關重要，對于不同群體和不同標記數量的水稻GWAS，沒有固定的閾值。通常有幾種方法用于確定P值的顯著性閾值，以控制全基因組關聯分析中發生的Ⅰ類錯誤，如最小貝葉斯系數(minimum Bayes factor，mBF)[27]、錯誤發現率(false discovery rate，FDR)[28-29]、Bonferonni校正(Bonferonni correction)[29-31]等。

多項研究證實，GWAS是揭示水稻復雜性狀遺傳變異和鑒定候選基因的有效手段[32-34]。例如，Huang等[35]對950份來自世界各地的水稻品種的抽穗期及籽粒相關性狀的表型進行GWAS分析，檢測到Waxy、ALK、Rc、OsC1及GS3基因的功能性突變與先前的報道一致，另外還發現了32個與抽穗期相關的新位點，10個與籽粒性狀相關的新位點。籽粒性狀是決定水稻產量和品質的關鍵因素，了解水稻籽粒自然變異的遺傳基礎可以幫助育種家培育高產水稻品種。Feng等[26]利用5 291個單核苷酸多態性(SNPs)對全球469份不同水稻種質進行了關聯定位，總共檢測到424個候選基因，除已知的基因外，還檢測到了11個新的關聯位點，另外還在3個不同環境中檢測到與粒長、粒寬、長寬比和千粒重相關的位點分別有3、18和2個，在2個不同環境中檢測到3、11、6和1個分別與粒長、粒寬、長寬比和千粒重相關的位點。這些位點對籽粒性狀的調節較穩定，受環境因素影響較小，將有助于利用分子標記輔助選擇進行水稻粒型改良育種。通過GWAS和基因功能分析，Duan等[36]鑒定出1個調控水稻籽粒大小的新基因GSE5，研究表明，GSE5功能缺失將導致籽粒變寬，粒重增加，而過表達GSE5基因將導致籽粒寬度變小。利用996 722個SNPs標記對270份水稻種質資源的粒長和粒寬進行了全基因組關聯分析，Ma等[37]鑒定出粒長和粒寬的數量性狀位點分別有5和4個，還鑒定出1個抗旱候選基因OsSNB同時負調控籽粒大小。通過候選基因分析發現，OsSNB基因啟動子區225 bp的Indel與粒寬高度相關，另外還設計了OsSNB_Indel2標記作為水稻粒寬改良的功能性標記。

分蘗數決定水稻的有效穗數，有效穗數是決定水稻產量的重要因素之一，分蘗數過多會導致過多的無效分蘗，分蘗數過少則會導致過少的有效分蘗，因此，適量的分蘗數是水稻高產的重要條件之一。研究表明[38]，水稻分蘗數主要受多基因調控，并且存在多條信號途徑共同影響水稻分蘗的發生，因此，為充分發揮水稻的產量潛力，必須挖掘更多有利用價值的水稻分蘗基因或有益突變體，并揭示其分子機制。利用GWAS已經成功鑒定出與水稻分蘗數自然變異相關的基因座。張繼峰等[39]利用788 396個SNPs和295份粳稻品種進行GWAS分析，檢測與粳稻分蘗數顯著相關的SNP位點，篩選得到LOC_Os09g25090和LOC_Os09g25100影響粳稻分蘗數的候選基因。Zhao等[34]利用219份韓國水稻高質量的SNPs數據，和不同生長階段水稻的分蘗數及與分蘗數相關的抽穗期進行GWAS分析，在與水稻分蘗數顯著相關的位點上檢測到幾個候選基因，其中，候選基因OsRLCK57參與分蘗發育，與分蘗前期的分蘗數相關；與發育階段轉換相關的OsHAM1、OsHAM2和OsTOC1與最大分蘗期的分蘗數相關；HD1與水稻的有效分蘗率和抽穗日期同時相關，說明光周期抽穗基因直接控制水稻的有效分蘗率。結果表明，參與發育階段轉換相關的基因，以及調控水稻分蘗發育的基因也可以決定水稻不同生育階段的分蘗模式。

每穗粒數作為水稻產量的主要組成因素，對水稻增產起著至關重要的作用。對不同環境條件下的自然優勢變異進行識別，可促進水稻產量的可持續遺傳改良。Xie等[40]利用1個包含154份秈稻和119份粳稻的微核心種質，在7個不同環境下進行了每穗粒數的關聯研究，在秈稻中確定了20個有益基因型和24個負控基因型，在粳稻確定了24個有益基因型和16個負控基因型。對有益基因在秈粳稻中的累積效應進行研究發現，在秈稻中鑒定得到的有益基因的積累，可提高所有環境中秈稻和粳稻的每穗粒數，而在粳稻中鑒定得到的有益基因的積累并無此明顯效應，特別是在短日照環境中表現明顯。每穗粒數取決于穗型結構，穗型結構由一系列不同分枝組成：穗軸、一級分枝、二級分枝、三級分枝及小穗。每個小穗將產生一粒種子，因此，研究和分析水稻穗型遺傳機制將有助于提高水稻的每穗粒數，進而提高水稻產量。Ta等[41]利用越南159個傳統水稻品種和3個參考水稻品種(Nipponbare、IR64和Azucena)組成的群體進行全基因組關聯分析，鑒定出29個穩定的穗部性狀QTLs，為研究穗部結構的遺傳決定因素提供了新的信息。

水稻增產可通過基因滲入或雜交改良重要農藝性狀來實現。雜種優勢是獲得水稻超高產育種的重要途徑之一，利用高密度標記對多親本群體進行遺傳作圖可以揭示雜種優勢的遺傳基礎。Zhen等[42]利用14個雄性不育系和39個恢復系雜交得到約500份F1雜種材料，通過全基因組關聯分析確定了多個與F1雜種的產量性狀、父本雜種優勢及配合力相關的QTL，其中Hd3a、qGL3、OsmiR156h和LAX2在這些QTLs中被確定為候選基因，進一步分析發現，雄性不育系和恢復系對雜種F1代的優勢等位基因貢獻不同，且對不同性狀的貢獻也不同。Huang等[43]開發了一種完整的基因組方法來構建1 495個優良雜交水稻品種及其自交系的基因組圖譜，與38個農藝性狀進行關聯分析，確定了130個相關位點，對雜合基因型效應的深入分析表明，雜種中只有少數幾個位點具有較強的超顯性效應，但產量與優勢等位基因的數量有很強的相關性。

2.3 候選基因關聯分析在水稻產量性狀遺傳研究中的應用

候選基因的關聯分析是基于基因水平將對目標性狀有很大貢獻的優勢等位基因從自然群體中挖掘出來。對于多效基因，不同的多態性位點可能與不同性狀獨立關聯，因此，候選關聯分析可以從基因水平剖析不同位點與性狀的相關性。Yu等[44]將504份栽培稻品種和約10萬個SNPs位點進行全基因組關聯研究，鑒定得到92個與粒長相關的新位點。在連鎖和關聯作圖的基礎上，掃描定位同一QTL的雙親雜交組合的Ho(觀察到的每個位點的雜合度)指數(即Ho-LAMap法)，鑒定出2個新的粒長基因。隨后利用Ho-LAMap法克隆1個新的基因OsLG3，正向調控籽粒長度，該基因可以在不影響稻米品質的情況下提高水稻產量。Xiong等[25]通過候選基因關聯分析，發現OsLG3啟動子的自然變異與水稻種子對滲透脅迫的耐受性有關，過表達OsLG3顯著提高了水稻對模擬干旱的耐受性，而抑制OsLG3的表達則導致了更高的敏感性。含有OsLG3IRAT109優良等位基因的導入系和轉基因系表現出較高的耐旱性，表明OsLG3的自然變異有助于水稻的耐旱性。以上結果表明，OsLG3是一個多效基因，它對水稻籽粒長度和耐旱性有共同的貢獻，是水稻抗旱性和產量改良的重要遺傳資源。Lu等[45]對104份栽培稻(O.sativa)和3份普通野生稻(O.rufipogon)的種質資源進行了測序，利用候選基因關聯分析技術，以鑒定Ghd7中影響株高、抽穗期、單穗粒數的不同等位基因/單倍型和關鍵SNP，除了先前報道的Ghd7的第一個外顯子過早終止突變導致多種性狀的表型改變外，還發現了位于ATG上游918 bp的C/T功能性突變，C/T突變可能通過改變基因表達調節株高。檢測到的與水稻重要農藝性狀顯著關聯的變異，可直接設計作為水稻育種的分子標記。Vemireddy等[46]通過對200個水稻品種進行定向重測序，揭示影響產量的6個關鍵基因(DEP1、Ghd7、Gn1a、GS3、qSW5和sd1)中與產量性狀顯著相關的有益等位基因，鑒定出91個新的有益等位基因，進一步的單倍型分析表明，部分水稻基因型具有罕見的單倍型，特別是高產品種，具有有益等位基因和罕見單倍型的水稻品種，在水稻育種中具有巨大的應用價值。鑒定出的優良單倍型可通過單倍型輔助育種應用于水稻育種研究中。此外，Abbai等[47]利用基因組測序數據及表型數，對120個基因進行候選關聯研究和單倍型分析，篩選出21個調控10個籽粒產量和品質性狀的強關聯基因，并報道了與水稻產量和品質顯著相關的優異單倍型。并進一步指出，利用目標基因的優良單倍型組合，通過單倍型育種開發出適合未來食物和營養需求的下一代定制水稻是可行的。

2.4 影響關聯分析結果的因素

眾所周知，群體結構可能會導致虛假的相關性，致使假陽性率升高，種群結構的影響可以通過在基因組中使用大量獨立的遺傳標記來修正[24]。此外，為了減輕并消除關聯分析中由群體分層引起的假陽性，前人提出了一系列方法[14]。其中，Q+K MLM模型和PCA+K MLM模型能夠較好避免由群體分層引起的假陽性[9]。研究者可根據研究需要選擇合適的統計方法。

3 關聯分析在水稻育種工作中的應用

水稻育種的本質是優良等位基因的選擇與聚合，許多基因及其不同的等位基因組合參與決定稻米的最終大小、形狀和重量[1]。等位基因在多個基因間的疊加性和上位性作用，使得一些有利等位基因的組合可以改良性狀，而其他組合無法改良性狀[48]。因此，為達到最佳的性狀改良目標，需考慮等位基因間相互作用。

單倍型育種是最近一種有希望開發定制作物品種的育種方法，它涉及到優良單倍型的鑒定及其在育種計劃中的應用[49]。關聯分析作為一種高效的QTL鑒定工具，可同時對多個等位基因進行鑒定，篩選到最優等位基因的效率更高。利用候選基因關聯分析對目標基因和相關性狀進行關聯研究，并結合單倍型分析，可鑒定得到對表型有益的自然變異位點和優異單倍型。所鑒定出的優良單倍型和攜帶這些優良單倍型的種質資源，將為利用單倍型育種技術開發新水稻品種提供重要的科學依據。此外，還可對鑒定得到的功能性突變位點設計引物，這將有助于分子標記輔助選擇育種。基于CRISPR-Cas9的QTL多重編輯是一種新的育種策略，既簡單又經濟高效[50]。研究者可利用CRISPR-Cas9的QTL多重編輯技術與關聯分析技術相結合，對于關聯分析鑒定得到的有益突變位點及優異單倍型進行驗證，為定制水稻育種方案設計提供科學依據，進一步提高育種效率。