微小RNA在輕度認知功能障礙診斷中的研究進展

張振華 馮曉東， 李瑞青 白俊敏 常文濤 胡延超

(1河南中醫藥大學，河南 鄭州 450000；2河南中醫藥大學第一附屬醫院)

輕度認知功能障礙(MCI)是介于正常老化與癡呆之間的一個臨床階段，主要表現為記憶功能下降，但日常生活能力尚未受到明顯影響〔1〕。有關流行病學調查顯示，我國65歲以上的老年人中，MCI的患病率為20.8%，進展為阿爾茨海默病(AD)年度轉化率為25.7%〔2，3〕；據最新統計顯示，我國AD患者超700萬，因其所致的社會經濟負擔總額2015已達到10 842.2億元人民幣(1 677.4億美元)，預計2030年將達到32 802.6億元人民幣(5 074.9億美元)〔4〕。但同時也有一部分MCI患者并未向AD轉化，而是長期保持穩定狀態，甚至隨著時間進展恢復到正常狀態〔5〕。據《中國癡呆診療指南(2017年版)》顯示，如果能早期識別MCI，并采取有效的干預措施，可能使AD相關的癡呆發病延遲5年〔6〕。因此，實現MCI的早期診斷尤為重要。目前尚無針對MCI診斷的統一標準。根據《2018中國癡呆與認知障礙診治指南》〔7〕，當前MCI及其高危人群的篩查主要依據臨床檢查，如影像學檢查及傳統認知功能評估；然而多數評估需在專業醫療機構完成且具有主觀性，同時個別檢查成本較高或存在有創性，因此并不適合大群體的初步篩查〔8〕。

微小RNA是一種內源性的長約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子〔9〕，在控制神經生長、免疫應答、細胞穩態及衰老方面有重要作用〔10〕。研究發現，微小RNA幾乎存在于所有生物體液中，如血液、腦脊液、尿液及唾液中〔11〕，與多種疾病的發生發展密切相關。近期一項關于果蠅記憶形成的研究證實miR-276a、miR-980和let-7在大腦特定區域的記憶形成中起重要作用〔12〕。因此，越來越多的學者將目光轉移到微小RNA與MCI的關系上，本文探討微小RNA在MCI及AD的發病中扮演的重要角色〔13，14〕，對實現MCI的早期診斷有著重要的意義。

1 微小RNA與MCI

現階段，MCI的病理機制尚不明確，不同亞型之間的變異較大。現有研究發現，腦脊液或血液中β淀粉樣蛋白(Aβ)42，總tau蛋白(t-tau)和磷酸化tau蛋白(p-tau)的表達水平出現異常的MCI患者更容易進展為AD型癡呆〔15～17〕，且腦脊液中Aβ42的降低和tau蛋白水平的升高有助于區分穩定型MCI和進展型MCI〔17〕。同時諸多研究表明人體內Aβ42和tau蛋白的表達水平與微小RNA密切相關，如Liu 等〔18〕發現miR-384過表達可抑制淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)和β-淀粉樣前體蛋白裂解酶(BACE)-1，與Aβ42呈負相關；Tian等〔19〕的動物研究證明對APP/PS1小鼠補充葉酸可上調miR-339-5p并下調BACE-1表達，從而減少APP/PS1小鼠腦內Aβ42的沉積；Smith等〔20〕也發現miR-132/212基因敲除小鼠的tau蛋白代謝出現異常，表現出過度磷酸化；同時miR-15家族的成員也可通過靶向細胞外信號調節激酶(ERK)1來調節tau蛋白磷酸化〔21〕。

2 腦脊液微小RNA與MCI

自Cogswell等〔22〕首次證明AD患者的腦脊液中含有微小RNA，并會隨病情進展而不斷改變以來，AD等神經退行性病變患者腦脊液中異常表達的微小RNA便引起國內外學者的廣泛關注。Zhu等〔23〕對30例MCI患者、26例AD患者及42例正常人腦脊液中的miRNA-210和血管內皮生長因子(miRNA-210的作用靶點之一，并與AD的進展有關)的表達水平進行分析發現，與正常對照組相比，MCI患者腦脊液中的miRNA-210和血管內皮生長因子的表達水平明顯下調，并且在AD患者中下調更為顯著。這一發現不僅有助于探查MCI和AD的發病機制，而且為實現MCI和AD的早期預防和治療奠定了研究基礎。Müller等〔24〕在早期研究已發現AD患者腦脊液中miR-27a、miR-29a、miR-125b和miR-146a的表達水平與正常對照組相比存在差異的基礎上，進一步擴大研究隊伍，納入39例MCI-AD患者，結果發現與無癡呆的對照組相比，MCI-AD患者腦脊液中的miR-146a水平升高，與AD患者相比，miR-27a、miR-125b和miR-146a的表達水平升高，但將樣品的性別、年齡、儲存方式及離心方案等作為混雜因子進行校正后，各組腦脊液中四種微小RNA的表達差異性丟失。同時，文章還指出由于實驗中存在技術差異及受腦脊液中血細胞的影響，在研究腦脊液中微小RNA水平時面臨很大的挑戰性，提出在后期的實驗中需要制定更加標準化的研究方案。

3 血漿微小RNA與MCI

Sheinerman等〔25〕的實驗結果首次證明了基于血漿中循環無細胞微小RNA的分析的微創測試對檢測MCI和AD及其他神經退行性變疾病的無癥狀階段是可行的；該實驗通過對MCI患者和正常人血漿中的微小RNA進行檢測計算，共篩選出13個有明顯差異的微小RNA用于進一步分析；然后對MCI組、AD組及年齡匹配的正常對照組血漿中13個表達差異的微小RNA測定分析得出，當將miR-132家族和miR-134家族分別與miR-491-5p和miR-370聯合應用時，可得到較好的診斷敏感度(79%～89%)和特異度(83%～100%)，并且在與正常對照組相比時能有效地區分出MCI和AD。這一研究為實現基于血漿微小RNA進行MCI和AD的早期檢測和診斷做出了重大貢獻。

Wang等〔26〕對遺忘性輕度認知功能障礙(aMCI)患者、AD及健康人血漿中的miR-107和BACE1 mRNA進行定量分析，結果顯示，與正常人相比aMCI及AD患者的miR-107和BACE1 mRNA表達水平有明顯的差異，并能以91.9%的準確率、98.3%的敏感性及82.7%的特異性有效區分aMCI和健康人；同時，研究還發現血漿中miR-107的表達水平與腦脊液中miR-107表達水平存在相關性，雖其內在機制尚不清楚，但仍表明血漿中的miR-107能夠反映aMCI患者腦內的某些改變，有極大的潛力作為MCI診斷的標志物。隨后，在該研究的基礎上，Wang等〔27〕使用基于表面的形態測量法(SBM)進一步對aMCI患者的皮質厚度(CT)、皮質表面積(SA)及皮質折疊(LGI)進行檢查，發現aMCI患者的前額皮質CT和左上額葉SA與認知正常者相比有所減少，同時與血漿中miR-107和BACE1的表達水平存在明顯的相關性。提示miR-107可能是MCI和AD發病機制的核心，并有助于實現MCI的早期診斷。

Kayano等〔28〕對受試者血漿中的微小RNA進行檢測，隨后采用差異相關分析對20種在MCI患者與健康人相比中具有顯著不同的微小RNA進行排序，得出其中兩對微小RNA，即hsa-miR-191和hsa-miR-101及hsa-miR-103和hsa-miR-222在兩組之間有較好的相關性，且其受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)最高(0.962)。此外，其他兩個包含hsa-miR-191和hsa-miR-125b的微小RNA相對的AUC值也大于0.95，通過進一步分析發現hsa-miR-191和hsa-miR-125b在MCI和癡呆進展中起關鍵作用，可能是MCI的診斷標志物。

劉辰庚等〔29〕在先前研究結果的基礎上，選取miR-29c進行臨床診斷檢測，結果顯示當截斷值為5.17時，與健康對照組相比，MCI診斷的靈敏度為91.70%、特異度為97.67%、AUC值為0.968；當截斷值為4.97時，與血管性癡呆患者相比，MCI診斷的靈敏度為87.07%、特異度為100.00%、AUC值為0.961，且當使用其他不同的截斷值將癡呆期AD患者與健康對照組和血管性癡呆患者相比時，可獲得更好的診斷敏感度和特異度。該研究表明血漿中miR-29c可作為MCI和AD診斷的生物標志物，進一步推動了血漿微小RNA作為MCI診斷標志物的臨床研究。

4 血清微小RNA與MCI

Geekiyanage等〔30〕在團隊前期研究結果的基礎上進一步比較了與年齡匹配的對照組相比MCI(僅指aMCI)和AD患者血清中5種miRNA(miR-137、miR-181c、miR-9、miR-29a和miR-29b)的濃度，雖然由于納入研究的樣本量較少，無法計算出具體診斷值，但此研究為通過檢測血清中微小RNA表達水平進行MCI和AD診斷奠定了前期基礎。

Zhang等〔31〕在前期動物實驗中，利用miRNA微陣列分析發現在快速老化(SAMP8)小鼠(一種與年齡相關的AD模型鼠)中miR-206、miR-132、miR-193b、miR-130b、miR-20a、miR-296、miR-329的表達明顯下調，且與AD的發生發展密切相關；因此為深入探究與AD等衰老相關的認知障礙中微小RNA與MCI的關系，Xie等〔32〕對MCI和正常對照組血清中上述7種微小RNA的表達水平進行檢測分析，發現在MCI患者中，血清miR-206和miR-132表現出顯著的上調，且與認知功能的下降程度密切相關；同時ROC曲線顯示當將miR-206和miR-132相匹配時AUC值最高，敏感度(85.5%)，特異度(98.5%)也高于單獨檢測。為深入探索血清中miR-206與miR-132差異表達的原因，有研究隨后又采用生物學檢測，發現腦源性神經營養因子(BDNF)和沉默信息調節因子(SIRT)1是上述兩種微小RNA的靶基因，且以往研究已證實BDNF和SIRT1與記憶功能和神經退行性疾病密切相關〔33，34〕，故認為血清中的miR-206和miR-132可能是MCI診斷的有效生物標志物。

既往諸多研究已經表明約有一半的MCI患者會向癡呆〔5〕尤其是AD轉化。因此對MCI患者進行長期追蹤研究十分重要。Xie等〔35〕通過對506例患有aMCI的患者進行5年隨訪研究發現，在進展為AD的128例aMCI受試者(27.9%)中，血清中miR-206的表達水平較高，SIRT1的表達水平較低，同時其簡易智力狀態檢查量表(MMSE)和蒙特利爾認知評估(MoCA)量表評分均較低，并與基線時血清中miR-206水平顯著相關。提示血清miR-206的較高表達水平可能是aMCI向AD轉換的獨立預后標志物。

Kumar等〔36〕在患有AD和MCI的患者的血清中鑒定了約6 631種類型的微小RNA，通過與正常對照組的對比分析，選出4種顯著上調的微小RNA(miR-455-3p、miR-3613-3p、miR-4674、miR-4668-5p)和表達下調的miR-6722進行二次篩選和驗證，發現與先前結果一致，即與對照組相比，血清中miR-455-3p和miR-4668-4p在AD或MCI患者中的表達上調最為顯著。此外，研究還發現在AD進展初期即MCI階段，患者血清中微小RNA的表達水平出現最高變異，這為在MCI階段進行血清微小RNA檢測提供了有效的依據，并有利于實現AD的早期預防和診斷。

綜上，雖然多數研究都表明外周來源的微小RNA能以較高的敏感度和特異度區分MCI、AD及認知正常者，但由于各研究間在研究方法上存在較大的異質性，導致難以取得研究成果的一致性，限制了微小RNA向臨床應用的轉化。同時，由于MCI是一種進行性疾病，不同階段的外周循環微小RNA可能存在較大差異，使得長期的縱向追蹤在探索微小RNA作為MCI診斷標志物的潛力上十分必要。因此，未來需要更高質量的研究，使用經過驗證的統一標準來選擇受試者，采用標準化的實驗室分析，同時進行必要的前瞻性隊列研究，以識別在MCI診斷中可靠的外周循環微小RNA，推動其向臨床應用轉化。