分蘗洋蔥化學(xué)成分及其抑菌活性

顧承真李 婷曾碧雪李文娟吳鳳芝曾任森

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，福建 福州350002；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

分蘗洋蔥Allium cepaL.var.agrogatumDon.屬于百合科蔥屬一年生草本植物，是洋蔥的變種之一。在我國(guó)黑龍江、吉林等地廣泛種植，資源豐富。分蘗洋蔥是一種獨(dú)具特色的藥食同源的保健品，營(yíng)養(yǎng)豐富，藥用價(jià)值也較高。分蘗洋蔥鱗莖中含有大蒜素等多種植物殺菌素，具有很強(qiáng)的殺菌能力［1?2］。近年來(lái)學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)分蘗洋蔥主要成分包括分蘗蔥頭苷、黃酮類(lèi)化合物［3?4］、含硫化合物、前列腺素A1［5］、甾體皂苷［6］、微量元素和氨基酸等［7］。研究表明黃酮類(lèi)化合物對(duì)自然界中許多病原微生物具有抑制和殺滅作用［8］。目前，天然產(chǎn)物的抑菌作用受到了廣泛關(guān)注，尤其是黃酮類(lèi)化合物。黃瓜根分泌物中含有的7，8?苯并黃酮能夠顯著抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)［9］。但分蘗洋蔥中含有的黃酮類(lèi)成分對(duì)農(nóng)作物病原菌的抑制作用有待于研究。

番茄枯萎病是由半知菌亞門(mén)鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌Fusarium.oxysporiumSchl.引起的一種土傳性、系統(tǒng)性病害［10?11］。前期研究發(fā)現(xiàn)分蘗洋蔥乙醇提取物對(duì)番茄枯萎病病原菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，但具有抑制番茄枯萎病病原菌生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此，本研究從分蘗洋蔥中分離得到2 個(gè)黃酮、1 個(gè)木脂素類(lèi)化合物和1 個(gè)氨基酸，并用微量稀釋法測(cè)定了這些化合物對(duì)番茄枯萎病病原菌生長(zhǎng)的影響。

1 材料

斜式N?1100S?W 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；VS?840 K?U 超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；BS?100A自動(dòng)部分收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；1000Y 多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；HVE?SO 型高壓滅菌鍋（華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司）；SHB?ⅢA 型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；ZF?20D 型暗箱三用紫外分析儀（驥輝分析儀器有限公司）；FPQ?300CY?30D 型人工氣候箱（寧波萊福科技有限公司）。GF254薄層硅膠（200 mm×200 mm，青島海浪硅膠干燥劑廠）；Bruker 600 MHz 核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker 公司）；Agilent 1290?6545 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定（美國(guó)Agilent 公司）；半制備液相色譜（江蘇漢邦科技有限公司）；Ultimate XB?C18半制備色譜柱（21.2 mm×250 mm，5 μm，月旭科技股份有限公司）。

分蘗洋蔥由東北農(nóng)林大學(xué)吳鳳芝教授提供并鑒定為正品，番茄枯萎病病原菌Fusarium oxysporumf.sp.LycopersiciSnyder et Hansen 菌株由福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院作物抗性與化學(xué)生態(tài)學(xué)研究所提供。

2 提取與分離

15 kg 分蘗洋蔥剝?nèi)[莖外皮，粉碎機(jī)粉碎成泥，在室溫下用95%乙醇浸提3 次，每次24 h，合并3 次提取液、減壓濃縮得到浸膏（1.6 kg）。適量蒸餾水稀釋?zhuān)謩e用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取部分（50 g）、乙酸乙酯萃取部分（210 g）、水部分（1.3 kg）。取分蘗洋蔥乙醇提取物的乙酸乙酯部分，加少量甲醇溶解、過(guò)濾，上凝膠Sephadex LH?20 柱，用甲醇?水（10 ∶90～100 ∶0）梯度洗脫，得到4 個(gè)部分Fr.A～D。Fr.A 上C18柱，用甲醇?水（10 ∶90～100 ∶0）洗脫，得到Fr.A1～A5，F(xiàn)r.A2 經(jīng)MCI 柱純化，甲醇?水（20 ∶80）洗脫，得化合物2（53 mg）；Fr.A4 上MCI 柱純化，用甲醇?水甲醇?水（35 ∶65）洗脫，得化合物1（141 mg）；Fr.A5 上MCI 柱純化，再用半制備液相甲醇?水（25 ∶ 75）純化，得化合物3（15 mg）。Fr.B 用C18柱分段甲醇?水（10 ∶90～100 ∶0），得到6 個(gè)部分Fr.B1～B6。Fr.B2 上MCI柱純化，用甲醇?水（40 ∶60）洗脫，得化合物4（23 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，分子式C15H10O7。ESI?MSm／z：303.0 ［M ＋H］＋。1H?NMR（DMSO?d6，600 MHz）δ：12.46（1H，s，OH?5），10.80（1H，s，OH?7），9.63（1H，s，OH?4′），9.35（1H，s，OH?3），9.34（1H，s，OH?3′），7.70（1H，s，H?2′），7.57（1H，d，J＝8.5 Hz，H?6′），6.91（1H，d，J＝8.5 Hz，H?5′），6.51（1H，s，H?8），6.22（1H，s，H?6）；13C?NMR（DMSO?d6，150 MHz）δ：156.6（C?2），136.7（C?3），176.5（C?4），162.4（C?5），98.6（C?6），164.6（C?7），94.1（C?8），156.8（C?9），104.3（C?10），122.6（C?1′），115.6（C?2′），145.7（C?3′），147.3（C?4′），116.1（C?5′），120.8（C?6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］ 報(bào)道一致，故鑒定為槲皮素。

化合物2：黃色粉末，分子式C21H20O12。ESI?MSm／z：465.1 ［M ＋H］＋。1H?NMR（CD3OD，600 MHz）δ：6.36（1H，s，H?2′），7.55（1H，dd，J＝10.5，1.98 Hz，H?6′），7.28（1H，d，J＝10.44 Hz，H?5′），7.73（1H，s，H?8），6.16（1H，s，H?6），4.90（1H，d，J＝8.76 Hz，H?1″），3.52（1H，m，H?2″），3.56（1H，m，H?3″），3.48（1H，m，H?4″），3.44（1H，m，H?5″），3.93（1H，dd，J＝2.5，15.4 Hz，H?6a″），3.73（1H，dd，J＝6.54，15.4 Hz，H?6b″）；13C?NMR（CD3OD，150 MHz）δ：148.4（C?2），138.1（C?3），177.6（C?4），162.8（C?5），99.5（C?6），165.8（C?7），94.6（C?8），158.4（C?9），104.7（C?10），127.8（C?1′），117.7（C?2′），146.9（C?3′），148.2（C?4′），116.6（C?5′），121.4（C?6′），103.8（C?1″），74.9（C?2″），78.5（C?3″），71.5（C?4″），77.7（C?5″），62.6（C?6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］ 報(bào)道一致，故鑒定為槲皮素?4′?O?β?D?葡萄吡喃糖苷。

化合物3：無(wú)色粉末，分子式C22H26O8。ESI?MSm／z：419.1 ［M ＋H］＋。1H?NMR（DMSO?d6，600 MHz）δ：3.09（2H，m，H?1／5），3.45（2H，m，H?4b／8b），3.73（2H，m，H?4a／8a），4.86（2H，d，J＝4.8 Hz，H?2／6），3.82（12 H，s，4?OCH3），5.43（2H，s，OH），6.61（4H，s，H?2′／6′／2″ ／6″）；13C?NMR（DMSO?d6，150 MHz）δ：53.7（C?1／5），56.1（4?OCH3），71.1（C?4／8），85.5（C?2／6），103.7（C?2′／6′／2″／6″），131.1（C?1′／1″），134.9（C?4′／4″），148.0（C?3′／5′／3″／5″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］ 報(bào)道一致，故鑒定為diasy?ringaresinol。

化合物4：白色粉末，分子式C11H12N2O7。ESI?MSm／z：205.1 ［M＋H］＋。1H?NMR（D2O，500 MHz）δ：7.62（1H，d，J＝9.5 Hz，H?4），7.42（1H，d，J＝8.2 Hz，H?7），7.19（1H，s，H?2），7.16（1H，t，J＝7.1 Hz，H?6），7.08（1H，t，J＝7.0 Hz，H?5），3.93（1H，dd，J＝4.8，8.1 Hz，?CH），3.38（1H，dd，J＝4.8，15.3 Hz，?CH2），3.19（1H，dd，J＝8.1，15.3 Hz，?CH2）；13C?NMR（D2O，125 MHz）δ：174.6（?CO），137.3（C?7a），126.6（C?3a），124.9（C?2），122.1（C?6），119.4（C?4），118.4（C?5），112.0（C?7），107.5（C?3），55.1（?CH），26.4（?CH2）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］ 報(bào)道一致，故鑒定為色氨酸。

4 生物活性

4.1 分蘗洋蔥乙醇提取物抑菌活性測(cè)試 培養(yǎng)基制備（PDA）為稱(chēng)取去皮土豆300 g，切碎加水400 mL 蒸煮30 min，用紗布過(guò)濾得澄清濾液，加入葡萄糖、瓊脂粉各30 g，攪拌至充分溶解，定容至1 500 mL 然后分裝到7 個(gè)250 mL 的三角瓶中，置于高壓滅菌鍋滅菌中滅菌30 min，待用。

分蘗洋蔥乙醇提取物浸膏用甲醇溶解與PDA培養(yǎng)基按一定比例混勻（培養(yǎng)皿中分蘗洋蔥乙醇提取物的質(zhì)量濃度為5 mg／mL），作為處理組，加等同量甲醇的PDA 培養(yǎng)基作為對(duì)照組。用打孔器將番茄枯萎病病原菌的菌餅打成直徑0.5 cm 的圓餅，接種在培養(yǎng)基上，置于28 ℃、相對(duì)濕度60%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后觀察其生長(zhǎng)情況。結(jié)果，對(duì)照組長(zhǎng)滿(mǎn)了病原菌，處理組上的病原菌幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，表明分蘗洋蔥乙醇提取物能顯著抑制番茄枯萎病病原菌的生長(zhǎng)，在5 mg／mL 的質(zhì)量濃度下，番茄枯萎病病原菌幾乎不能生長(zhǎng)。

4.2 各化合物抑菌活性測(cè)試 使用微量稀釋法，通過(guò)96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板完成4 個(gè)化合物對(duì)番茄枯萎病病菌的最低抑制濃度值（MIC）的測(cè)定。陽(yáng)性對(duì)照藥品為伏立康唑，稱(chēng)取20 mg，甲醇溶解制成2 mg／mL貯備液。

稱(chēng)量2 mg 刃天青粉末，制備成質(zhì)量濃度為100 μg／mL 的指示劑，加入到96 孔酶標(biāo)板的第11列孔中，將7 mL 質(zhì)量濃度為143 μg／mL 的刃天青溶液和3 mL 含真菌的培養(yǎng)液混勻，使刃天青的最終質(zhì)量濃度為100 μg／mL，分別往第1～10 列和第12 列的每個(gè)培養(yǎng)孔中加入100 μL，往每行的第一個(gè)孔中加入90 μL 100 μg／mL 刃天青指示劑和10 μL質(zhì)量濃度為2 mg／mL 的化合物或陽(yáng)性對(duì)照貯備液，混勻，從中取100 μL 溶液打到第2 個(gè)孔中，依此類(lèi)推，一直到第10 個(gè)孔，最后移走100 μL。化合物和陽(yáng)性對(duì)照貯備液的質(zhì)量濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19 μg／mL，每個(gè)96 孔培養(yǎng)板的前6 行是化合物處理的，后2 行分別是含甲醇和伏立康唑的對(duì)照。最后，將培養(yǎng)板放在25 ℃培養(yǎng)箱中，直至第12 列培養(yǎng)液有藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，統(tǒng)計(jì)每個(gè)化合物的MIC值，整個(gè)過(guò)程約需要13～15 h。

結(jié)果，化合物1～2 對(duì)對(duì)番茄枯萎病病原菌具有較好的抑制作用，最低抑制濃度（MIC）分別為25.0、12.5 μg／mL，陽(yáng)性對(duì)照伏立康唑的最低抑制濃度（MIC）為0.39 μg／mL，其他2 個(gè)化合物對(duì)番茄枯萎病病原菌生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

5 討論

本研究從分蘗洋蔥乙醇提取物中分離獲得4 個(gè)化合物，發(fā)現(xiàn)1～2 對(duì)番茄枯萎病病原菌生長(zhǎng)具有較好的抑制作用，可為分蘗洋蔥的利用提供理論依據(jù)，并為合成新型除菌劑提供先導(dǎo)化合物。另外，番茄枯萎病為土傳病害，分蘗洋蔥與番茄間作能否抑制番茄枯萎病，分蘗洋蔥根系分泌物中是否含有槲皮素及其具體含量尚不明確，還有待進(jìn)一步研究。