脊髓損傷對血-脊髓屏障水代謝機制的影響

郭鐵峰 鄧強 杜凱然 柳樹英 張彥軍 楊志華 李中鋒 楊鎮源 彭冉東 李軍杰 徐浩軍

(1甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅中醫藥大學)

脊髓損傷(SCI)是脊柱外科常見的嚴重疾病之一,屬中醫學外傷瘀血所致“腰痛”“痿證”“癃閉”等范疇，常伴隨損傷節斷以下肢體功能障礙，是國內外脊柱外科領域亟待解決的重大醫學問題之一。繼發性SCI(SSCI)為傷后幾小時至幾天發生的一系列激活的自身破壞過程，所產生的脊髓損害并不亞于原發損傷，對繼發性損傷的預防及治療，往往決定了后期脊髓神經再生及功能的恢復與重建，而“血-脊髓屏障”(BSCB)損害所引起的水腫、椎管內壓力增高，組織灌注降低則是繼發性損傷中最主要的病理過程，所以在SSCI早期保護BSCB功能、逆轉脊髓水腫對SCI預后具有重要的意義。隨著該病診療發展的需要，SSCI防治的相關研究仍存在亟待解決的關鍵問題：①目前研究尚不能完全闡述SSCI中BSCB功能異常的分子生物學機制，以致在該病治療方面缺乏明確的理論基礎與科學依據；②激素沖擊療法作為SSCI主要治療手段之一，但常引起一過性高血壓、高血糖、心動過速、電解質紊亂、嚴重感染、甚至死亡等嚴重并發癥，臨床應用具有一定局限性。因此，研究并闡明SSCI中BBSC功能異常的相關基因調控機制，并尋找一種有效、快速且不良反應低的治療方法一直是脊柱外科領域的研究熱點之一。本文就SCI對BSCB水代謝機制影響研究進行綜述。

1 SSCI中BSCB水代謝異常機理

SCI通常與BSCB破壞具有直接關系，導致血管源性脊髓水腫，主要是細胞外空間過量的水積累〔1〕。SCI分為原發性SCI和SSCI。其中，SSCI 產生的一系列繼發性損害，大多由于損傷節段缺血缺氧，BSCB連續毛細血管內皮炎性改變，通透性增加等原因所引起，包括水腫、炎性反應、局部缺血-再灌注損傷、Ca2+溢出及過氧化基團等，這些異常變化會進一步加重原發病灶周圍神經組織的破壞性病變，導致神經功能損害持續發展并加重，其對脊髓的破壞遠遠超過了原發性損傷，繼發性損害的程度直接決定該病預后。繼發性損害的病理改變主要是以血管源性水腫與細胞毒性水腫為基礎發展而來。在急性損傷發生后，BSCB中連續性毛細血管內皮損壞，內皮細胞間隙增寬，血管壁連接松散〔2〕，多糖-蛋白質復合物所帶的負電荷短暫消失，血管外炎癥因子、血漿蛋白逐漸進入脊髓實質聚集，引起水腫并加重炎性改變〔3〕。另一方面，創傷所致脊髓微循環障礙，使損傷節段缺血缺氧不斷加重，導致星形膠質細胞營養供給受到抑制，腺苷三磷酸(ATP)合成減少，細胞離子轉運受到抑制，細胞內滲透壓異常改變，大量組織液進入神經細胞內，細胞腫大，即出現細胞毒性水腫，水腫導致細胞外間隙變狹窄，在電解質異常的同時，進一步壓迫神經組織，白質水腫及低灌注將促進繼發組織壞死，此外，水腫致脊髓內壓增高，加重髓內微循環障礙，使組織因缺氧、缺血致液化壞死。所以，創傷后若不及時逆轉脊髓水腫，則有可能形成水腫-缺血的惡性循環，而 BSCB 對水調節功能的異常改變正是導致這一系列病理連鎖反應的根本機制。

2 水通道蛋白(AQPs)在SCI中的表達

AQPs，又稱水孔蛋白，是細胞膜上內在膜蛋白，屬于膜通道家族中的一類蛋白，是參與水分子跨膜運輸的重要通道〔4〕。SCI發生后，AQP-1在星形膠質細胞、神經元纖維、室管膜細胞表達迅速增加，持續表達上調可持續11個月，AQP-1長時間持續表達上調不僅會導致神經元及軸突水腫而發生腫脹，而且會導致星形膠質細胞向損傷區域移動變相促使瘢痕組織形成〔5〕。國外有研究顯示，SCI后細胞中的AQP-9表達上調后可減少SCI對AQP-9的誘導，側面減少脊髓水腫，減少神經元凋亡〔6〕。據研究發現有3個AQPs在中樞神經系統(CNS)內表達較高，其中AQP-4隸屬于水通道家族，大量分布在腦-脊髓屏障的星形膠質細胞之中，主要作用是水分子快速跨膜轉運，在中樞神經組織水分調節代謝方面發揮出至關重要的作用〔2〕。隨著對其研究的深入發現，SCI造成星形膠質細胞膜上AQP-4的表達變化，是導致脊髓水腫及神經細胞毒性水腫重要生物學機制之一。由此可見SCI后，AQP-4與SCI的病理機制密切相關，其最為重要的表達在星形膠質細胞、神經元、室管膜細胞及內皮細胞〔7〕，在SCI整個病理機制的發展過程中起到重要作用。

3 BSCB調控水代謝的分子生物學機制

3.1AQP-4在SSCI中的表達 研究證實 SSCI 中 BSCB 損傷所致連續毛細血管內皮及星形膠質細胞胞膜上AQP-4的表達變化，是發生血管源性水腫、細胞毒性水腫的主要分子生物學機制之一。AQP-4 由美國科學家在1988年研究人類紅細胞時發現〔8〕。其作為調控水分子平衡的重要信號蛋白在 SSCI 脊髓水腫的形成和消退中起重要作用〔9〕。BSCB 與“血-腦屏障”相似，基本結構包括毛細血管內皮細胞及其間的緊密連接(TJ)、基膜、周細胞和星形膠質細胞終足。AQP-4 主要在星形膠質細胞上表達，分布于包繞血管周圍的星形膠質細胞足突上，當發生脊髓損傷時，其在與血管直接接觸的足突上呈極性分布，同時其也沿著神經纖維網的突起廣泛分布，參與形成與腦脊液接觸的軟腦膜和室管膜表面屏障〔10〕，AQP-4 的極性分布主要是指其在毛細血管、蛛網膜和軟腦膜等與星形膠質細胞及其終足直接接觸的部位上具有高表達、高活性的特點，說明 AQP-4 作為膠質細胞與腦脊液和血管間的水調節與轉運的重要結構基礎。其在維持中樞神經系統水平衡中起了至關重要的作用〔11〕。研究認為〔12〕，AQP 參與中樞神經系統水腫的發生發展過程，在缺血再灌注損傷皮層區域的 AQP-4 表達增加，說明 AQP-4 在缺血導致的腦水腫中起重要作用，而在小鼠腦缺血模型中，AQP-4 敲除可使細胞毒性腦水腫減輕且神經功能得到改善。 Li等〔13〕證實腦水腫的減輕伴隨著 AQP-4 表達下降，AQP-4 的表達與脊髓水腫呈正相關。在脊髓損傷后的急性水腫過程中，AQP-4 表達迅速升高〔14〕，損傷后1 d，出現血管源性水腫，AQP-4及其 mRNA 表達開始增加，3 d達高峰并出現細胞毒性水腫〔15〕。此外，鈉鉀泵作用于 AQP-4的K27和W30位點，病理狀態下鈉鉀泵的失調對 AQP-4的水通透性產生影響，說明 AQP-4 參與了從血管源性水腫到細胞毒性水腫的整個病理過程。雖然目前已經證實 AQP-4 與脊髓損傷后的水、離子失衡的相關性及重要性。但AQP-4作為 BSCB 水代謝的重要調控蛋白，對其調控機制卻知之甚少，所以明確調節AQP-4表達變化的分子機制將為 SSCI 脊髓水腫的治療提供新的思路與靶點。

目前，研究表明 AQP-4 存在多種蛋白的調控位點，其中 Ser180 和 Ser111 是參與AQP-4動態調節的主要位點，作用于該位點的蛋白包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)〔16〕、蛋白激酶(PK)C〔17〕、鈣/鈣調素依賴蛋白激酶(CaMK)Ⅱ、 酪蛋白激酶(CK)Ⅱ、PKA磷酸化位點〔18〕。當脊髓髓損傷時絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路被激活，抑制該通路中蛋白的表達后，AQP-4 的表達亦隨之發生改變，說明 AQP-4 有可能受到 MAPK 通路的調控〔19〕。有研究顯示〔20〕鈣調蛋白、PKC、PKG、PKA 等均可在催化AQPs上的特定的絲氨酸殘基(Ser111)或 Ser180 磷酸化從而使 AQP的活性上升，增加膜對水的通透性。同時有脊髓損傷的相關研究顯示AQP-4表達受 MAPKs 信號通路的控制，當阻斷 MAPKs 信號通路后，AQP-4在 BSCB 中血管周圍的星形膠質細胞及毛細血管內皮上的表達及脊髓水腫程度均發生明顯變化〔21，22〕。證實 MAPKs 通路確實通過調控 BSCB 中AQP-4的表達，干預了脊髓損傷后水腫的形成與消退。深入研究發現，PKC 抑制劑可抑制磷酸化表達，PKC發揮作用的信號轉導途徑可能在AQP-4表達的轉錄水平而不涉及蛋白質的從頭合成〔23〕，提示相關信號通路調控 AQP-4 mRNA 的表達變化可能是通過轉錄因子進行的，而這種轉錄因子有可能是一個新的“神經保護用因子”，在 SCI 早期脊髓水腫的防治中發揮作用。

3.2長鏈非編碼RNA(lncRNA)MALAT1對AQP-4調控防治SSCI lncRNA作為非編碼蛋白質的新型基因表達調控因子，參與生物體的各種生理及病理過程。MALAT1是張海天等〔24〕發現的一個反義 lncRNA，位于 11 號染色體，是有絲分裂進程所必須的基因。其在促進癌細胞侵襲和增殖方面發揮重要作用。研究發現 MALAT1 在血管內皮細胞的生理病理變化中起關鍵調控作用，通過抑制 MALAT1 的表達，可增加內皮細胞基礎出芽和促進細胞遷移，反之 MALAT1 過表達可抑制內皮細胞出芽。并且運用 GapmeR(lncRNA 的抑制劑)、siRNA 分別干擾 MALAT1 表達后，再用血管內皮生長因子(VEGF)刺激血管內皮細胞，均可誘導內皮細胞不連續的出芽生長，影響細胞周期進程，使細胞分裂期 S 期減少〔25〕。研究表明〔26〕MALAT1可通過調控 VEGF 的表達促進間充質干細胞的血管新生，說明在體外實驗中，MALAT1 可影響內皮細胞出芽、遷移和增殖。在小鼠單側下肢缺血模型中，抑制MALAT1可減少血流的恢復和后肢局部缺血后毛細血管的密度〔27〕。由此證實MALAT1促進血管內皮細胞增殖、新生血管化、促進損傷后血流恢復和毛細血管密度的作用。同時，在神經再生的研究中發現MALAT1可通過介導PKC增加腦損傷中神經元的成活率〔28〕，且可通過激活細胞外調節蛋白激酶 (ERK)/MAPK 信號通路，在神經生長早期發揮關鍵作用〔29〕，說明lncRNA MALAT1 可能是 MAPK 家族信號通路的上游調控因子，參與了神經損傷后的修復與重建，加之其在毛細血管內皮調控方面發揮的重要作用，推測MALAT1 可能是脊髓損傷后調控 AQP-4 的表達的關鍵轉錄因子。

綜上，SCI疾病病理機制具有可變化性，治療方案復雜多樣。盡管SCI發生生理、病理機制已逐漸被掌握，但是針對該疾病的治療目前仍只能治其表，未能達到治本的效果〔30〕。對于SSCI的防治，是目前仍需首要解決的問題，其直接影響后期神經軸突的再生及肢體感覺功能的恢復及重建。如何減輕脊髓水腫、降低椎管內壓力、提高血液的再灌注是治療SCI首要解決的問題。目前已有研究表明AQP-4參與水分可進出在BSCB或神經興奮、SCI后星形膠質細胞的遷移、軸突再生等功能，已作為調控水分再平衡及參與SSCI后脊髓水腫及消退的重要信號蛋白〔31〕。本研究發現，在急性脊髓損傷初期，AQP-4表達下降相對伴隨腦水腫的減輕，脊髓損傷后水腫的嚴重程度與AQP-4表達的呈正相關。如何調控AQP-4的表達是減輕神經細胞凋、減輕脊髓水腫、促進軸再生的首要關鍵問題。實驗研究表明lncRNA是高度異變并且具有高度的功能多樣性，其主要功能依賴于RNA分子符合不同結構和分子相互作用的能力。此外lncRNAs表達還與人類許多疾病密切相關，包括癌癥和心血管和神經變性疾病〔32〕。lncRNA參與SSCI主要的表達基因為MALAT1，此因子為lncRNA的反義因子〔33〕，促進內皮細胞的生長、間充質干細胞的血管新生及SCI后血流的恢復等方面均發揮著重要的作用。同時，MALAT1能增加腦損傷中神經元的成活率，并且通過ERK/MAPKs 信號通路的調節，促進神經細胞的生長。因此推測其與AQP-4之間或許存在一定關聯。ERK/MAPKs 信號通路的調節、AQP-4 的表達與 BSCB 損傷后的水代謝及神經修復密切相關，但具體基因調控機制尚不明確。目前，國內有學者采用中醫辨證論治的理念對 SSCI 的防治展開相關研究，但對該病的中醫病因病機認識不同，治療側重點不同，未形成統一的、行業內認可的辯證標準，阻礙了中醫藥防治本病的進一步發展，影響了中醫藥結合中醫辨證論治理論優勢的發揮和學術交流。