激素性股骨頭壞死中細胞自噬的作用

陳俊名 劉又文 何沛霖 張虹 張俊濤 孫含瑞 岳辰

(1福建中醫藥大學，福建 福州 350001;2河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院);3河南中醫藥大學)

股骨頭壞死(ONFH)是骨科常見的一種由多種因素造成的疾病〔1〕。長期或短期過量使用糖皮質激素(GCs)是發生ONFH的常見誘因，其中長期過量使用GCs會有超過40%的人群發生激素性股骨頭缺血性壞死(SONFH)，SONFH是一種代謝性疾病，其發病特點為多位雙側發病，且壞死范圍較大，發病年齡主要為中年及青年，研究發現其進展具有不可逆性〔2〕，且目前缺乏有效的治療方法。SONFH有許多發病機制，如破壞成骨分化和脂肪形成分化之間的平衡，脂肪栓塞，循環障礙，細胞凋亡和功能障礙，髓內壓力變化及凝血功能障礙〔3，4〕等。GCs作用下細胞凋亡及正常細胞活性受抑的原因尚不完全明確，有觀點表明：在SONFH發生、發展過程中，細胞凋亡及正常骨活性受抑與其細胞自噬失調密切相關〔5～7〕。

1 細胞自噬

1.1細胞自噬的概念 自噬(Autophagy)即指細胞通過產生“自噬體”吞噬胞內衰老、失能的細胞結構并與溶酶體融合后通過水解酶將上述物質降解并回收利用的過程。當細胞處在饑餓、內質網應激、輻射、缺氧等條件刺激下，便會轉錄并表達自噬的相關基因(ATG)并將在細胞內形成自噬體，自噬體隨后與溶酶體結合后吞噬胞內衰老、失能的細胞結構，降解回收胞內異常大分子化合物和受損細胞器〔8～11〕，最后這些小分子物質透過溶酶體進入細胞質，重新參與細胞能量代謝。該過程為細胞生存提供能量前體物質，是細胞的自我保護行為，是機體適應傷害性刺激的表現，該過程在維持細胞穩態、細胞正常功能、抑制細胞凋亡、促進細胞發揮正常功能方面發揮重要作用〔12，13〕。自噬的種類主要分三種，包括巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)及分子伴侶介導的自噬(CMA)〔14〕。

1.2細胞自噬的分子生物學過程 自噬的過程是一個連續動態的自我保護過程，其中自噬體形成是細胞自噬的重要環節，通過對微生物的觀察發現，細胞自噬主要分為5個階段，細胞自噬相關基因ATG約為35種，這35種ATG在自噬體形成的過程中，每一種ATG各自表達所產生的功能不一樣，整個自噬過程與自噬相關基因關聯密切〔15〕。有研究表明：當細胞在消耗營養的過程中，雷帕霉素復合-1(mTOR-1)會被抑制，然后形成ULK1-ATG13-FIP200復合體(ULK1-ATG13-FIP200)，自噬正調控蛋白是提高自噬活動性的重要調節蛋白，隨后ATG5與ATG12相互結合，成為ATG5與ATG12的復合體，其在微管相關蛋白的促進和驅使下會相互連接進一步形成微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)，當形成自噬體標記蛋白后，由于這些蛋白的所處環境及特性會在已形成的自噬體膜上發生連接反應，形成最終的自噬體〔16〕。當自噬被激活時，自噬活動便開始，已成形的自噬體會包裹機體不再需要的細胞器及蛋白質聚合體，并攜帶需要回收的細胞器與蛋白質聚合體與溶酶體進行融合，這個過程會將這些物質進行分解重吸收后合成新的大分子。其中重要的調節因素包括了mTOR-1、絲氨酸、P62等。研究表明：mTOR可以使Atg13磷酸化，磷酸化后不能再與Atg1結合，便不能促進細胞內自噬的發生〔17〕。正常情況下，細胞自噬處于低水平狀態，當處于異常的情況下時，細胞自噬會被激活從而具有保護功能，但是只有處在適度的自噬狀態下才會起到保護細胞的作用。自噬失調包括了自噬活性過低和自噬活性過高，二者都會抑制細胞自噬正常功能，介導細胞凋亡并對機體產生損害〔18，19〕。當細胞自噬活性過低時，細胞自噬無法正常及時清除細胞內受損、失能的細胞器及蛋白質聚合體，細胞內物質無法循環利用，自我保護能力降低。而當細胞自噬活性過高時，自噬性溶酶體會吞噬異常及一些正常的細胞器及蛋白質聚合體，細胞正常結構也會因此受損〔20，21〕。

2 SONFH與細胞自噬

2.1SONFH發展過程中細胞自噬的相關信號通路 自噬是復雜的生物學過程，與之相關的信號通路有多條〔22〕，現有研究發現與SONFH有關的細胞自噬信號通路主要包括磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路與磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信號通路。研究表明mTOR可分為mTORC1和mTORC2，其中mTORC1是細胞自噬調節過程中的主要蛋白。

AMPK/mTOR是調控自噬最為關鍵的信號通路〔23，24〕。其調控細胞自噬的途徑為：AMPK/mTOR信號通路中關鍵酶為AMPK，它由α、β、γ三個亞基構成，γ亞基為AMP及ATP的結合位點；當各種原因導致胞內AMP水平升高，ATP水平降低時，更多的AMP會與γ亞基結合，AMPK會發生磷酸化并被激活為p-AMPK存在；形成p-AMPK后可直接激活ULK1而啟動細胞自噬。而另外一種方式也可通過磷酸化Raptor及TSC2的Ser而對mTOR產生降低活性的作用。mTOR是自噬的主要抑制活性的信號，它的最主要功能是將ATG13磷酸化，使其不能與ULK1結合形成自噬體而關閉自噬啟動信號〔25～28〕。因此，AMPK信號通路的激活表現為AMPK激活，mTOR受抑，ULK1被激活而最終啟動自噬。PI3K/Akt/mTOR信號通路是細胞自噬經典的信號通路〔29〕，PI3K是一種脂質激酶，參與到細胞增殖及代謝等多種過程，其作用是可以轉導下游信號，從其結構特點進行分類主要分為三種類型，其中第一種PI3K是由亞基(P85)和催化亞基(P110)組成一種異二聚體，主要又分為2個類別，第一個子類別為A類PI3Kα，β和δ，其是由p85α，p85β，p55γ三個中的一個和p110α，p110β或p110δ3個催化亞基之一組成；第二個子類別是由調節亞基p101和催化亞基p110γ組成的B類PI3K。Akt PI3K，是PI3K活動下游的直接效應分子，其功能主要是可以調節多個下游信號通路促進細胞的增殖分化及代謝。其中細胞自噬可以通過2個途徑被激活，第一個為mTOR依賴途徑，第二個為非mTOR依賴途徑。第一種途徑即PI3K/Akt/mTOR信號通路調控的細胞自噬，現有研究表明，這個信號通路在細胞自噬誘導SONFH中起到了非常重要的作用〔29〕，其中以mTOR為核心的經典自噬通路的研究最多見。

2.2SONFH的病因研究 GCs作用下誘發ONFH是許多疾病使用激素藥物治療后常見的并發癥，根據近年研究發現，激素可以誘導成骨細胞和軟骨細胞程序性死亡的發生，并且會發生局部無菌性炎癥，促進非創傷性ONFH的發生〔30〕。相關動物實驗表明：長期及過量應用激素或者在關節內直接注射激素都會增加股骨頭壞死的發生概率，其具體機制主要考慮：由于長期及大量激素使用會導致股骨頭血供不足，致使股骨頭內成骨細胞和骨髓細胞死亡，隨著嚴重程度加重造成股骨頭內支撐結構(骨小梁)改變，股骨頭隨后發生塌陷，并表現為髖部疼痛和髖關節活動受限〔31〕。GCs作用下股骨頭細胞凋亡，成骨活性下降，骨修復能力不足，繼而導致骨小梁力學強度降低是誘發SONFH的常見機制，是出現股骨頭塌陷的重要因素之一〔32～34〕。

而目前國內外對于SONFH的具體機制仍沒有完全研究清楚，近年的進展更傾向于研究基因的表達與調控在疾病發生、發展過程中的關系，關于SONFH與細胞自噬的具體機制被學者重視，激素可以導致股骨頭血供不足，是發生細胞自噬失調的重要原因〔35〕。研究者傾向于關注自噬及其信號通路在各種疾病的發生發展中的具體機制，目前大多數研究通過研究mTOR的上下游信號通路來確定調控細胞自噬的關鍵〔36〕。

2.3超量激素引起自噬失調誘發SONFH的機制 在SONFH發生、發展過程中，細胞凋亡及正常成骨活性受抑與其自噬失調密切相關〔5，14，7〕。She等〔6〕發現，SONFH患者壞死骨組織中成骨細胞自噬相關基因表達水平明顯高于正常骨組織。通過阻斷自噬相關AMPK/mTOR信號通路，成骨細胞自噬表達水平明顯降低，但成骨細胞凋亡水平卻進一步加重。Li等〔5〕研究也得到相似的結論，并認為對成骨細胞自噬水平的調控將成為SONFH治療的新靶點。Zhang等〔7〕研究表明，在生理低劑量地塞米松作用下，成骨細胞的自噬被激活(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)而產生自我保護，此時細胞凋亡水平極低。但加入自噬抑制劑后，成骨細胞凋亡水平則明顯提高。Han等〔37〕的研究則證實，地塞米松作用下大鼠成骨細胞發生凋亡，成骨活性明顯受抑，同時其自噬水平(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，Beclin-1)較正常有所增高。然而，通過自噬激活劑進一步提高成骨細胞自噬表達水平后，細胞凋亡減少，同時成骨活性明顯提高。上述結果充分說明GCs作用下細胞自噬失調是導致其凋亡、骨活性受抑，從而誘發SONFH發生、發展的重要原因之一。

AMPK/mTOR信號通路在GCs介導的細胞自噬失調中發揮重要調控作用〔6，27，28〕。GCs是調控機體能量代謝的重要物質，能夠誘導胞內ADP/ATP發生變化，通過影響AMPK表達水平而調控mTOR及ULK1的表達量，影響細胞自噬水平〔26〕。相關研究證實SONFH患者壞死骨組織AMPK表達水平明顯高于正常骨組織，通過AMPK抑制劑(compound C)抑制AMPK表達水平后，成骨細胞凋亡水平進一步加重〔6〕。Guo等〔27〕的研究表明，通過compound13(AMPK激活劑)提高AMPK的表達水平能夠明顯提高小鼠成骨細胞的生物活性，抑制其凋亡。另一項研究也通過OSU53(AMPK另一種激活劑)對人OB-6成骨細胞進行類似研究，得到相同結論〔28〕。因此，激活AMPK/mTOR信號通路可能提高成骨細胞自噬水平而減輕其自噬失調程度，抑制凋亡、增強成骨活性，從而成為干預SONFH發病進程的新途徑。PI3K/Akt/mTOR信號通路是經典的自噬信號通路之一，研究表明該通路現有已知通路中唯一的抑制性通路，可以通過活化該通路來抑制自噬，保護細胞并抑制其程序性死亡，反之抑制該通路就能誘導細胞自噬和凋亡。其中mTOR是PI3K/Akt/mTOR信號通路種重要組成蛋白，PI3K/Akt通路是mTORC1主要的上游調節劑，抑制ULK復合物的形成，可以阻斷內質網膜形成脫落進而對細胞自噬形成負調控〔38〕。在SONFH中可能存在自噬過度活化的現象，過度活化自噬會導致骨壞死的發生，我們可以通過誘導并激活PI3K/Akt/mTOR信號通路促進細胞存活并抑制過度活化自噬，有助于阻礙SONFH的發生及進展〔39〕。

以上研究表明，細胞自噬影響SONFH發生及發展進程中成骨細胞和破骨細胞的相互作用。很早就有研究證實了SONFH發病機制與成骨細胞和破骨細胞的分化及凋亡有關系，而細胞自噬與細胞凋亡同樣關系非常密切〔40〕。這些研究表明細胞自噬可以增加或者減少細胞凋亡及增加骨量等，而細胞自噬在SONFH中具有雙向調節作用。

3 總結與展望

細胞自噬是真核細胞內重要的維持細胞內環境及穩態的機制，根據相關研究及實驗觀察證實：長期和過量使用激素可以導致ONFH。SONFH中細胞自噬是程序性細胞死亡研究的熱點與難點，近年來的研究充分說明了細胞自噬廣泛參與到SONFH的全過程。雖然在自噬的分子機制和調控機制等方面有一些研究進展，但是細胞自噬調控SONFH的作用機制的研究還比較少，就目前而言，僅僅只能說明細胞自噬誘發SONFH有直接或間接的關系，其關系主要有2種：一種是正面調節作用，即細胞自噬活性適當提高可以抑制SONFH壞死的進程，可以改善激素導致股骨頭缺血壞死的情況，如果降低自噬活性則會起到相反作用；另外一種是則是負面調節作用，即細胞自噬活性適當降低可以抑制SONFH壞死的進程，可以改善激素導致股骨頭缺血壞死的情況，如果提高自噬活性則會起到相反作用。基于現有研究可以展望如果我們在SONFH發病機制中進一步研究細胞自噬并取得突破性成果，我們將有望通過調控(激活或者抑制)細胞自噬來達到改善疾病進程的目的，為SONFH的治療提供更多可靠的辦法和更有效的方案。