MicroRNA在非酒精性脂肪肝病中的研究進(jìn)展

楊立英 張賀 劉倩倩 任路平

(河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 石家莊 050000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的肝臟損傷，其病理學(xué)改變與酒精性肝病相似，其疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌〔1〕。NAFLD發(fā)病率逐年增加，是當(dāng)今重要的公共健康問(wèn)題。NAFLD確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，最近表觀遺傳學(xué)的發(fā)展使人們對(duì)NAFLD中基因型與表型的關(guān)系有了更深刻的理解。研究表明〔2〕，多種微小RNA(miRNA)異常與肥胖、胰島素抵抗、糖尿病和NAFLD有關(guān)。MicroRNA是一種由18～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過(guò)部分抑制或降解靶向的mRNA，在調(diào)控基因表達(dá)中起重要作用〔3,4〕,參與細(xì)胞凋亡、分化、發(fā)育、增殖和代謝等廣泛的生物學(xué)過(guò)程〔5〕，最近大量研究表明miRNA失調(diào)與NAFLD密切相關(guān)，本文對(duì)MicroRNA在NAFLD中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 與NAFLD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA

1.1miR-122與NAFLD的相關(guān)性 miR-122是肝中表達(dá)最豐富的miRNA，在調(diào)控脂質(zhì)代謝中有重要作用〔6〕，Cheung等〔7〕研究將非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及代謝綜合征患者與健康人的肝臟miRNA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)46種差異表達(dá)miRNA，其中23種miRNA明顯上調(diào)，23種miRNA明顯下調(diào)。這些miRNA的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)包括調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、膽固醇代謝、氧化應(yīng)激和凋亡的基因。其中，NASH患者miR-122水平低于對(duì)照組63%，并且在體外實(shí)驗(yàn)沉默和過(guò)表達(dá)miR-122分析其靶基因，沉默miR-122后，脂肪酸合酶(FAS)、羥甲基戊二酸單酰輔酶(HMG-Co)A 還原酶、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)-1c和 SREBP-2表達(dá)增加，而過(guò)表達(dá)miR-122后，上述脂質(zhì)合成的基因表達(dá)減少，推測(cè)miR-122的異常表達(dá)與NASH有關(guān)。一些由化學(xué)和飲食干預(yù)構(gòu)建的NAFLD模型的研究進(jìn)一步證明了miR-122的重要性。Yamada等〔8〕用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠構(gòu)建NAFLD模型，分別在第2、6、10周檢測(cè)大鼠血清和肝臟miR-122的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高脂組大鼠血清miR-122表達(dá)上調(diào)而肝臟miR-122表達(dá)下調(diào)。既往多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD中肝臟的miR-122下調(diào)，但是也有一些相反結(jié)論。有研究在臨床樣本的肝臟穿刺活檢發(fā)現(xiàn)，和正常肥胖對(duì)照組比，NAFLD組的肝臟miR-122表達(dá)明顯上調(diào)〔9〕。還有研究發(fā)現(xiàn)，重度脂肪變性患者的肝臟miR-122水平明顯高于患者輕度脂肪變性患者〔3〕。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠肝臟miR-122水平明顯高于普通對(duì)照組，同時(shí)脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶增加，脂肪酸氧化關(guān)鍵酶降低〔10〕。上述差異是否受實(shí)驗(yàn)方法和模型區(qū)別影響，還需要進(jìn)一步的研究。有學(xué)者認(rèn)為〔11〕，miR-122的表達(dá)和靶基因及對(duì)肝臟脂代謝的作用，可能受到營(yíng)養(yǎng)和能量狀態(tài)的影響。

1.2miR-185與NAFLD的相關(guān)性 Wang等〔12〕研究了miR-185的減少或增加對(duì)脂質(zhì)代謝和胰島素敏感性的影響。研究以高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠和棕櫚酸培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株(HepG2)細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察到在這兩種模型中miR-185顯著下調(diào)，且miR-185表達(dá)水平在棕櫚酸培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中的降低具有時(shí)間和劑量依賴性。在HepG2細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)染方式抑制了miR-185后，參與調(diào)節(jié)脂肪從頭合成和膽固醇的合成的關(guān)鍵基因表達(dá)增加，如FAS、3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶a還原酶(HMGCR)、SREBP1c和SREBP2；相反，在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-185導(dǎo)致胰島素受體底物(IRS)-2表達(dá)增加，改善了胰島素敏感性和脂肪變性；與對(duì)照動(dòng)物相比，高脂肪的飲食小鼠經(jīng)miR-185治療后肝臟脂質(zhì)沉積顯著改善并且miR-185的誘導(dǎo)通過(guò)上調(diào) IRS-2增強(qiáng)了胰島素敏感性。體內(nèi)外研究一致表明了miR-185在肝細(xì)胞中調(diào)節(jié)脂肪酸代謝和膽固醇體內(nèi)平衡及在改善胰島素敏感性的重要作用。

1.3miR-21與NAFLD的相關(guān)性 研究發(fā)現(xiàn)miR-21在NASH患者的肝臟中上調(diào)〔7〕，這在高脂飼養(yǎng)的小鼠和脂肪酸干預(yù)的細(xì)胞中得到進(jìn)一步證實(shí)〔13〕。miR-21主要表達(dá)在膽管和肝臟炎癥細(xì)胞中，antagomir-21(miR-21的拮抗物質(zhì))能抑制肝臟miR-21表達(dá)，減少肝細(xì)胞損傷、炎癥和纖維發(fā)生。脂肪性肝炎的小鼠和人的肝臟miR-21高表達(dá)，同時(shí)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α減少，而在PPARα缺陷小鼠中，antagomir-21的作用喪失。PPARα 可能是miR-21影響NAFLD的主要靶點(diǎn)〔14〕。

在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)〔15〕，敲除miR-21/miR-21*的小鼠的糖耐量減低，脂肪變性及肥胖均得到改善。特異性地在肝細(xì)胞中缺失miR-21/miR-21*也得到類(lèi)似改善，表明肝臟miR-21/miR-21*在與飲食誘導(dǎo)的肥胖相關(guān)的代謝紊亂中的關(guān)鍵作用。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究表明，肝細(xì)胞中的miR-21/miR-21*缺失增加了胰島素敏感性并調(diào)節(jié)了脂肪酸攝取、脂肪的脂質(zhì)從頭合成、糖異生和葡萄糖輸出等多種關(guān)鍵代謝轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)〔15〕。miR-21 可能是非酒精性脂肪肝和代謝綜合征的治療靶點(diǎn)。

1.4miR-34a與NAFLD的相關(guān)性 miR-34a是肝臟中對(duì)脂質(zhì)反應(yīng)最靈敏的miRNA之一，在高脂飲食的小鼠中miR-34a的表達(dá)水平顯著上調(diào)，且其在人類(lèi)中的表達(dá)水平與脂肪性肝的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)〔16,17〕。有研究發(fā)現(xiàn)病態(tài)肥胖受試者的肝臟miR-34a表達(dá)增加，推測(cè)肥胖者的脂肪性肝炎可能與miR-34a的異常有關(guān)〔18〕。Ding等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)在脂肪變性誘導(dǎo)的肝細(xì)胞和高脂肪飲食喂養(yǎng)的小鼠的肝組織中miR-34a水平顯著上調(diào)，其靶基因PPARα和沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT1)明顯下調(diào)。而沉默miR-34a導(dǎo)致SIRT1和PPARα及下游基因的初始表達(dá)增加，激活了中樞代謝傳感器腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，從而改善肝臟脂肪變性程度。

1.5miR-451與NAFLD的相關(guān)性 NAFLD患者血清miR-451水平較高〔5〕，而在NAFLD患者的肝臟、棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞及高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的肝組織中，miR-451表達(dá)顯著降低。miR-451的缺失導(dǎo)致白細(xì)胞介素(IL)-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α和核因子(NF)-κB激活，促進(jìn)腫瘤形成，相反miR-451過(guò)表達(dá)抑制了這些通路，表明miR-451有預(yù)防從單純性脂肪肝病進(jìn)展為嚴(yán)重晚期肝病的潛在治療作用〔20〕。

1.6miR-200c與NAFLD的相關(guān)性 Feng等〔2〕發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的大鼠肝臟和游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞miR-200c表達(dá)上調(diào)。最近的研究一項(xiàng)中，給予miR-200c敲除的小鼠蛋氨酸和膽堿缺乏飲食(MCD)，發(fā)現(xiàn)miR-200c缺乏增加了微粒體三酰甘油轉(zhuǎn)移蛋白，減輕了肝臟脂肪變性和炎癥〔21〕。

2 循環(huán)miRNA可能成為NAFLD的診斷工具

大多數(shù)NAFLD患者無(wú)癥狀，在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中偶然發(fā)現(xiàn)。目前NAFLD的篩查方法多采用超聲和CT掃描，耗時(shí)較長(zhǎng)。肝組織穿刺活檢是評(píng)價(jià)NAFLD患者分期的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，肝組織穿刺是一種有創(chuàng)的侵入性技術(shù)。循環(huán)miRNA有望成為NAFLD的篩查和疾病嚴(yán)重程度判斷的簡(jiǎn)單方法。

大量研究表明，多種miRNA可在血清和唾液等各種體液被檢測(cè)到〔22,23〕，因?yàn)橥饨鏡NA酶幾乎無(wú)處不在，細(xì)胞外miRNA通常是短暫的，而短序列的內(nèi)源性循環(huán)miRNA已被證明是非常穩(wěn)定的，表明其有作為健康和疾病的生物標(biāo)志物的潛在作用〔22,23〕。對(duì)循環(huán)miRNA的分析表明，血液中miRNA攜帶的粒子有不同的形式，循環(huán)miRNA可存在在非膜核糖核酸蛋白復(fù)合物中且與Ago2直接結(jié)合，還可能與各種脂蛋白結(jié)合，此外，miRNA還可以細(xì)胞外囊泡(ev)包膜的形式釋放。在正常情況下，存在于非膜核糖核酸蛋白復(fù)合物中且與Ago2結(jié)合的循環(huán)miRNA占主導(dǎo)地位，而疾病狀態(tài)與ev包膜的循環(huán)miRNA有密切關(guān)系〔23,24〕。越來(lái)越多的證據(jù)表明，NAFLD中ev包膜的miRNA與脂肪毒性引起的肝細(xì)胞損傷有關(guān)〔25〕。

很多學(xué)者對(duì)循環(huán)miRNA與NAFLD的關(guān)系進(jìn)行了大量研究，其中對(duì)miR-122的研究最為廣泛。在一項(xiàng)關(guān)于循環(huán)miRNA與肝纖維化嚴(yán)重程度和肝細(xì)胞癌發(fā)展之間關(guān)系的研究中，發(fā)現(xiàn)與19名健康對(duì)照人群相比，34例NAFLD患者的miR-122、miR-34a和miR-16顯著升高，并與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)〔26〕。

Csak等〔27〕研究發(fā)現(xiàn)在蛋氨酸-膽堿缺乏性飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的血清中循環(huán)miR-122水平明顯升高，由于miR-122水平與血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平相關(guān)，該研究認(rèn)為循環(huán)中miR-122的升高可能是其從受損肝細(xì)胞釋放的一個(gè)指標(biāo)。隨后對(duì)高脂肪飲食誘導(dǎo)大鼠NAFLD的研究發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有血清ALT變化的情況下，miR-122水平升高了10倍，這表明血清miR-122水平可能是NAFLD早期的生物標(biāo)志物〔8〕。

在一項(xiàng)檢查血清miRNA的預(yù)測(cè)價(jià)值研究中，發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)miRNA(miR-34a，miR miR-192，miR-27b，miR-122，miR-22，miR-21，miR-197，miR-30c和miR-16)與NAFLD嚴(yán)重程度相關(guān)。 此外，與藥物誘導(dǎo)的肝損傷患者相比，miR-192，miR-27b，miR-22，miR-197和miR-30c可能對(duì)NAFLD具有特異性〔28〕。

雖然循環(huán)miRNA是備受關(guān)注的生物標(biāo)志物，但循環(huán)miRNA與肝病之間的因果關(guān)系尚不完全清楚。目前還不確定循環(huán)miRNA的釋放是腫瘤特異性的還是肝臟來(lái)源的〔22,29〕。此外，估計(jì)在血清或血漿中約有100～500個(gè)循環(huán)的miRNA，而在肝臟組織中發(fā)現(xiàn)的miRNA數(shù)量明顯更高，這表明除了關(guān)注循環(huán)miRNA，同時(shí)也要重視基于組織的miRNA研究，從而更全面地揭示全部范圍miRNA在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用。

3 miRNA可能是NAFLD的治療靶點(diǎn)

miRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的有重要作用，因此有可能是有意義的治療靶點(diǎn)。由于miRNA通常通過(guò)抑制基因轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮作用，所以實(shí)踐中可通過(guò)沉默來(lái)抵消miRNA的抑制作用，或者恢復(fù)對(duì)miRNA對(duì)靶向基因的抑制作用，從而發(fā)揮其干預(yù)作用。已有一些相關(guān)研究為肝臟疾病的治療提供線索。有研究者發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞中miR-21上調(diào)，故通過(guò)反義寡核苷酸抑制miR-21導(dǎo)致HCC細(xì)胞遷移和克隆受到抑制，并且誘導(dǎo)了HCC細(xì)胞系的凋亡和壞死〔30〕，肝癌生長(zhǎng)對(duì)miR-21的依賴也在異種移植瘤模型中得到證實(shí)〔30〕，這為抑制miR-21治療HCC提供了支持，使其成為一種有希望的藥物干預(yù)手段。

另外，miR-122在HCC中下調(diào)，其在肝癌發(fā)生中的作用有待闡明〔31〕。Miravirsen是一種用于抑制miR-122的鎖定核酸修飾的反義寡核苷酸，以肝臟表達(dá)的miR-122為靶向，是治療丙型肝炎病毒(HCV)感染的新藥，目前已經(jīng)進(jìn)入2期臨床試驗(yàn)階段，由于miR-122在肝臟中表達(dá)較多，除了參與丙肝病毒的復(fù)制，還與膽固醇調(diào)節(jié)和脂代謝密切相關(guān)，對(duì)NAFLD具有潛在的治療作用〔32〕。

綜上，miRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控及其與NAFLD的關(guān)系已成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。由于方法上的進(jìn)步，通過(guò)微陣列分析和二代測(cè)序技術(shù)來(lái)鑒別miRNA的表達(dá)變得更容易、更全面。循環(huán)miRNA可能為更可靠的生物標(biāo)志物。在防止非特異性效應(yīng)的前提下，為了治療目的而模擬或抑制miRNA的方法將越來(lái)越完善。miRNA研究的深入發(fā)展對(duì)人們對(duì)NAFLD發(fā)病機(jī)制的闡明、預(yù)測(cè)和治療具有重要意義。