血培養瓶增菌法快速鑒定和快速藥物敏感性試驗可行性分析

喬玉莉，黃宗帥，田月如，關 明，蔣曉飛

（1. 普洱市人民醫院檢驗科，云南 普洱 665000；2. 湘雅常德醫院，湖南 常德 415000；3. 復旦大學附屬華山醫院，上海 200040）

隨著抗菌藥物、免疫抑制劑的廣泛應用及侵入性醫療操作的開展，顱內感染成為神經外科患者治療過程中最嚴重的并發癥，其致殘率和致死率較高，治療難度較大。常規腦脊液培養是將腦脊液濃縮集菌后培養，獲取單個菌落后再進行鑒定和藥物敏感性分析，耗時，且陽性率低，無法滿足臨床抗感染治療需求。張瞿璐等[1]發現，采用血培養瓶進行腦脊液培養能提高腦脊液培養陽性率，縮短培養時間。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）可直接鑒定血培養陽性樣本[2-3]及中段尿[4-5]、無菌體液[6]等臨床樣本中的病原微生物。基于此，我們開發了“直接將腦脊液注入血培養瓶進行增菌培養，報陽后直接離心富集細菌，采用MALDI-TOF MS快速鑒定，并直接進行體外藥物敏感性試驗”的快速腦脊液培養細菌鑒定和藥物敏感性試驗的方法，并與常規的腦脊液濃縮集菌后培養，獲取菌落后再進行鑒定和藥物敏感性分析進行比較，不一致的鑒定結果以測序結果為參考，評估快速鑒定和快速體外藥物敏感性試驗方法的可行性與臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2018年12月—2019年7月華山醫院檢驗科送檢的1 446例腦脊液樣本，隨機抽取345例按血培養瓶增菌法進行培養，報陽后，分別采用BD凝膠分離血清管直接離心集菌（快速法）富集細菌和常規轉種培養（常規法）獲取純細菌，革蘭陰性菌及革蘭陽性菌同時采用紙片擴散法、微量肉湯稀釋法和Vitek 2 Compact自動化鑒定藥敏儀（儀器法）進行體外藥物敏感性試驗，隱球菌采用ATB FUNGUS2藥物敏感性試驗紙條進行體外藥物敏感性試驗；其他1 101例采用常規濃縮集菌培養法進行培養，有細菌生長的樣本通過常規轉種獲取純細菌后進行鑒定。

1.2 儀器與試劑

Micro flex LT型MALDI-TOF MS儀、MSP 96孔靶板、IVD細菌測試標準品和α-氰基-4-羥基肉桂酸基質均購自德國Bruker Daltonik公司，BACTECTMFX血培養系統、需氧血培養瓶、厭氧血培養瓶及真菌/分枝桿菌血培養瓶、BD凝膠分離血清管（SST管3.5 mL）均購自美國BD公司，BacT/Alert 3D、Vitek 2 Compact自動化鑒定藥敏儀、需氧血培養瓶、厭氧血培養瓶、AST-P639鑒定卡、AST-N335鑒定卡、酵母樣真菌藥敏試劑盒均購自法國生物梅里埃公司。血平板、巧克力平板及中國藍平板均購自上海科瑪嘉公司，葡萄球菌藥敏板、腸桿菌科藥敏板均購自溫州康泰公司，甲酸購自美國Sigma Aldrich公司。

1.3 方法

1.3.1 鏡檢 挑取血培養儀中報陽的腦脊液血培養瓶中菌落，涂片并革蘭染色，顯微鏡下觀察結果，并記錄。

1.3.2 MALDI-TOF MS鑒定 腦脊液快速鑒定方法參考AZRAD等[7]的改良方法，并稍作修改：從每個陽性血培養瓶中轉移5 mL到血清分離膠管，1 237×g離心10 min，棄上清。取出沉淀物并置于1.5 mL Eppendorf管中，17 949×g離心1 min，棄上清。用無菌去離子水洗2遍。取1 μL沉淀置于MSP 96孔靶板上，各靶點覆蓋1 μL 70%的甲酸，干燥后，再加入1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸基質溶液，采用Microflex LT系統和MALDI BIOTYPER 3.0軟件進行質譜分析。純培養物是由陽性血培養瓶轉種至血平板，培養過夜后挑取的單個菌落，將其均勻涂抹在MSP 96孔靶板上，進行MALDI-TOF MS分析。根據STEVENSON等[8]提出的判斷標準，結合文獻[4，9-10]，每個樣本點樣4次，當至少有2次結果一致，且第1個鑒定分數≥1.4時，判定為鑒定準確。

1.3.3 快速和常規體外藥物敏感性試驗 快速藥物敏感性試驗直接取上述細菌沉淀物，常規藥物敏感性試驗取血培養陽性轉種至血平板上的菌落，分別配制成0.5麥氏濁度菌懸液，分別采用紙片擴散法、微量肉湯稀釋法和儀器法進行藥物敏感性試驗。隱球菌快速和常規藥物敏感性試驗板嚴格按照酵母樣真菌藥敏試劑盒說明書要求，采用顯色微量肉湯稀釋法檢測入組菌株5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。質控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922）、大腸埃希菌（ATCC 35218）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、糞腸球菌（ATCC 29212），購自國家衛生健康委臨床檢驗中心。

結果判讀和數據分析按照美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2018年版標準，替考拉寧參考CLSI 2016年版標準，替加環素參照歐州藥敏試驗委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）2012版標準。一致率參照CLSI商品化微生物鑒定及藥物敏感性試驗系統相關指南要求。

1.4 統計學方法

采用 SPSS 17.0軟件及WHONET 5.6軟件進行統計分析。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦脊液血培養瓶增菌法與常規濃縮集菌培養法報陽時間及陽性率的比較

腦脊液血培養瓶增菌培養法與常規濃縮集菌培養法的陽性率分別是13.91%（48/345）和2.91%（32/1 101），差異有統計學意義（χ2=60.889，P=0.000）。腦脊液樣本血培養瓶增菌法臨床常見細菌的平均報陽時間是（1.95±0.77）d，而常規濃縮集菌培養臨床常見細菌的平均檢出時間為（1.67±0.41）d，差異無統計學意義（t=-1.605，P=0.119）；2種方法檢出真菌的時間分別為（2.16±0.60）和（3.9 2±1.0 8）d，差異有統計學意義（t=-3.497，P=0.002）。血培養瓶增菌法報陽細菌中革蘭陰性桿菌、革蘭陽性球菌、革蘭陽性桿菌及真菌分布情況分別為16.33%（8/49）、34.69（17/49）、10.20%（5/49）及38.78%（19/49），常規濃縮集菌培養法分別為43.75%（14/32）、34.38%（11/32）、6.24%（2/32）及15.63%（5/32），差異有統計學意義（χ2=9.212，P=0.027）。

2.2 腦脊液血培養瓶增菌法陽性樣本快速法與常規法鑒定結果的比較

采用常規轉種方法從48份腦脊液血培養瓶增菌法陽性樣本中分離鑒定出49株細菌，而采用快速法鑒定出44株細菌，快速法未能鑒定出的5株細菌來自4例樣本，分別是：混合感染1例、陽性球菌2例和真菌1例，符合率為89.80%，見表1。快速法鑒定出7株革蘭陰性菌（混合感染未鑒定出）和5株革蘭陽性桿菌，與常規法鑒定結果相符。常規法鑒定的17株革蘭陽性球菌中，快速法鑒定出12株葡萄球菌（包含1株厭氧的解糖葡萄球菌）、2株藤黃微球菌、1株葡萄球菌和1株鏈球菌（鑒定到屬），另外1株細菌因混合感染而未鑒定出，此3株未納入快速法鑒定的陽性率計算中，但鑒定到屬的樣本仍舊做了快速藥物敏感性試驗。常規法鑒定的19株真菌中，快速法鑒定出15株新型隱球菌、2株念珠菌和1株皮炎外瓶霉，有1株革蘭染色似隱球菌，常規法鑒定到屬、快速法未鑒定出，后經測序驗證為新型隱球菌。2種方法鑒定結果比較，差異無統計學意義（χ2=0.116，P=0.990）。

表1 快速法與常規法鑒定結果比較

2.3 腦脊液血培養瓶增菌法陽性樣本快速法與常規法藥物敏感性試驗結果比較

2.3.1 腦脊液血培養瓶增菌法陽性樣本革蘭陰性菌快速法與常規法藥物敏感性試驗結果比較 快速法鑒定出7株革蘭陰性菌，混合感染未鑒定出，無法比較藥物敏感性試驗結果；另外1株嗜麥芽窄食假單胞菌無相應藥敏卡，未使用儀器法進行藥物敏感性試驗，未統計；紙片擴散法和微量肉湯稀釋法只選擇左氧氟沙星、復方磺胺甲噁唑、米諾環素和頭孢他啶-他唑巴坦4種抗菌藥物。3種藥物敏感性試驗方法中僅有微量肉湯稀釋法的替加環素分類一致率為83.33%（5/6），其他抗菌藥物分類一致率均為100%。

2.3.2 腦脊液血培養瓶增菌法陽性樣本革蘭陽性球菌快速與常規藥物敏感性試驗結果比較 革蘭陽性球菌的3種藥物敏感性試驗中，紙片擴散法紅霉素分類一致率為84.62%（11/13），微量肉湯稀釋法紅霉素和慶大霉素分別為84.62%（11/13）和91.67%（11/12）；儀器法克林霉素和慶大霉素分類一致率均為91.67%（11/12），其他抗菌藥物（阿米卡星、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、環丙沙星、左氧氟沙星、亞胺培南、美羅培南、米諾環素、頭孢他啶-他唑巴坦、復方磺胺甲噁唑、替加環素）快速法和常規法藥物敏感性試驗結果完全一致。

2.3.3 腦脊液血培養瓶增菌法陽性樣本隱球菌快速法與常規法藥物敏感性試驗結果準確率 快速法鑒定出15株新型隱球菌，1株革蘭染色似隱球菌，但未鑒定出結果，常規應鑒定到屬，后經測序驗證為新型隱球菌，也納入隱球菌分別進行快速法與常規法藥物敏感性試驗。2種藥物敏感性試驗結果完全一致。

2.3.4 腦脊液血培養瓶增菌法陽性樣本標準一致性比較 以純培養微量肉湯稀釋法為標準，快速微量肉湯稀釋法和快速儀器法的標準一致率分別為98.56%（273/277）和97.83%（271/277），快速微量肉湯稀釋法的微小錯誤率分別為1.44%（4/277），快速儀器法的錯誤率為2.17%（6/277），見表2。

表2 腦脊液血培養瓶增菌法陽性樣本快速法藥物敏感性試驗的標準一致率 株（%）

3 討論

MALDI-TOF MS相對于傳統細菌培養鑒定，可以更快速、準確地鑒定出血培養陽性樣本中的細菌，縮短血培養報告結果的時間，為臨床提供更為及時、準確的用藥指導。由于腦脊液中細菌含量少，且陽性率較低，一定程度上限制了其應用，很多學者借助MALDI-TOF MS積極尋找有效且快速的檢測方法[11-13]。為縮短藥物敏感性試驗的報告時間，本研究在分離膠-質譜法快速鑒定結果的基礎上，以增菌后分純取菌的鑒定和藥物敏感性試驗為常規方法，并以此為標準，采用紙片擴散法、微量肉湯稀釋法和儀器法分別對快速鑒定和藥物敏感性試驗結果的一致性進行評估。

本研究發現，常規培養與血培養瓶增菌培養腦脊液樣本臨床常見細菌的報陽時間差異無統計學意義（P=0.119），而真菌的報陽時間差異有統計學意義（P=0.002），這可能與2種方法的培養時間不同有關。另外，本研究還發現，常規培養的陽性率較血培養增菌培養低，且差異有統計學意義（P=0.000），與文獻報道[3]相符。本研究中，血培養瓶增菌法對難培養的真菌，尤其是隱球菌的檢出率明顯提高，提示腦脊液血培養瓶增菌法不但未影響其報陽時間，還提高了總體陽性率及真菌的檢出率，證實了腦脊液血培養瓶增菌法的優越性。

本研究中，直接離心富集的快速法與常規法相比，能快速鑒定腦脊液血培養陽性樣本中的絕大多數病原菌，且2種方法鑒定結果符合率達89.80%，差異無統計學意義（P＞0.05）。快速法與常規法鑒定結果比較發現，直接離心集菌后采用MALDI-TOF MS鑒定革蘭陰性菌的符合率優于革蘭陽性菌，可能與革蘭陽性菌壁厚、菌體小有關，與李媛睿等[14]的報道基本一致。方毅等[15]、馬堅等[16]在血培養快速鑒定中也報道了相似的鑒定結果。本研究腦脊液血培養鑒定的隱球菌所占比例較高，可能與醫院收治患者類型有關。綜上所述，本研究認為直接使用報陽樣本沉淀物快速鑒定的結果準確、可靠。

以常規轉種培養法的藥物敏感性試驗結果為參考，本研究主要比較了革蘭陰性菌、革蘭陽性球菌及隱球菌的直接離心法快速藥物敏感性試驗結果，發現快速藥物敏感性試驗與常規藥物敏感性試驗結果高度一致，提示快速藥物敏感性試驗的結果在指導臨床抗菌藥物使用方面有較大的參考價值。另外，為檢驗快速藥物敏感性試驗（快速微量肉湯稀釋法和快速儀器法）結果的準確性，本研究以純培養微量肉湯稀釋法為標準，快速微量肉湯稀釋法和快速儀器法的標準一致率分別為98.56%和97.83%，顯示快速藥物敏感性試驗結果具有較高的臨床可信度。

常規轉種過夜孵育取菌的藥物敏感性試驗是推薦方法，其結果準確、可靠。但是采用常規操作流程，從陽性報警到藥物敏感性試驗報告結果用時較長。有研究發現抗菌藥物治療延遲會造成患者病死率上升、住院日延長和醫療費用增加等嚴重后果[17]。本研究中，將腦脊液注入血培養瓶后，陽性率及培養菌株的多樣性有明顯優勢，結合直接取菌后采用MALDI-TOF MS快速鑒定結果，腦脊液增菌培養陽性樣本的快速與常規藥物敏感性試驗結果高度相符，大大縮短了報告時間，對臨床用藥提供了快速、準確的依據。本研究也存在一定局限性，收集樣本量偏少，可能使結果不夠全面，后續將增加樣本量及菌種的多樣性進行進一步的研究。