冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者外泌體lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA網絡分析

黃浪浪 徐驲 劉中勇

(1江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2江西中醫藥大學附屬醫院)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)是指冠狀動脈發生粥樣硬化引起管腔狹窄或閉塞，導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病〔1〕。CHD是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型，嚴重危害人體健康。據《中國心血管病報告2018》〔2〕指出，我國現有心血管病人數2.9億，其中CHD 1 100萬，大陸地區CHD介入治療總例數為753 142例，患病率和死亡率呈現快速上升趨勢，給國家醫療衛生帶來了巨大的經濟負擔。

外泌體是由細胞分泌的一種直徑在40～100 nm之間的囊泡，屬于細胞外囊泡的一種，含有脂質、蛋白、受體、不同種類的RNA等成分，可以調節受體細胞的行為〔3〕，并且可以作為疾病的循環生物標志物，在血液、眼淚、唾液、尿液、腹水等多種體液中都廣泛存在〔4〕。研究表明〔5～8〕，外泌體不僅能在生理情況下通過轉運蛋白質、RNA、DNA等物質在細胞間通訊發揮作用，還能影響缺血再灌注損傷、血管鈣化、動脈粥樣硬化等病理狀態。有證據表明〔9〕，非編碼(nc)RNAs，包括微小RNA(miRNA,miR)、長非編碼(ln)cRNA和環狀(circ)RNA在各種疾病的發生發展中發揮著關鍵作用。lncRNA/circRNA可以作為競爭內源(ce)RNAs，通過其miRNA反應元件與miRNA競爭性結合，然后間接調節miRNA靶向mRNA的表達〔10〕。近年來，隨著基因芯片高通量測序技術的發展和各大生物信息數據庫的建立，為CHD的研究提供了有利條件。本研究通過生物信息學方法，對CHD患者和正常人的血液外泌體數據進行分析，探究關鍵的lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA ceRNA軸并預測其可能的靶基因，為臨床上診斷和治療CHD提供新的方向。

1 材料與方法

1.1數據收集 從exoRBase數據庫(http://www.exorbase.org/)下載正常人和CHD患者血液外泌體樣本中的mRNA、lncRNA和circRNA數據。其中正常樣本32個，含有16 932個mRNA、10 626個lncRNA和40 645個circRNA；CHD樣本6個，含有13 848個mRNA、1 628個lncRNA和3 914個circRNA。

1.2外泌體中差異mRNA、lncRNA和circRNA的篩選 在R3.6.2版本軟件環境下，應用Bioconductor中limma軟件包對CHD樣本和正常樣本數據進行mRNA、lncRNA和circRNA差異分析。所有數據經軟件進行背景校正、標準化和log2轉換。

1.3預測差異mRNA、lncRNA和circRNA結合的miRNA 利用TargetScan網站(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRanda網站(http://www.microrna.org/microrna/home.do)、miRcode網站(http://www.mircode.org/)和ENCORI網站(http://www.starbase.sysu.edu.cn/)分別對mRNA、lncRNA和circRNA結合的miRNA進行預測。將得到的結果導入Cytoscape 3.7.2(https://cytoscape.org/)軟件中，對調控網絡結果進行可視化。

1.4網絡中mRNA功能通路注釋分析 為進一步了解mRNA的功能和主要作用通路，將上述篩選得到的mRNA輸入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)，選定物種為“homo sapiens”，設定閾值P<0.05進行GO富集和 KEGG 通路注釋分析，并對富集分析結果進行可視化處理。

2 結 果

2.1差異mRNA、lncRNA和circRNA的篩選 通過R軟件對CHD樣本和正常樣本數據進行處理及差異分析，得到312個差異mRNA、43個差異lncRNA和85個差異circRNA。其中上調的mRNA 55個，下調的mRNA 257個；上調的lncRNA 24個，下調的lncRNA 19個；上調的circRNA 4個，下調的circRNA 81個。差異mRNA、lncRNA和circRNA中上調與下調最顯著的前5個見表1。前20個繪制雙向聚類熱圖，橫坐標為樣本，縱坐標為差異基因。如圖1～3所示。

圖1 差異表達mRNA熱圖

圖2 差異表達lncRNA熱圖

圖3 差異表達circRNA熱圖

2.2lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA調控網絡 將上述得到的差異mRNA、lncRNA、circRNA分別輸入TargetScan、miRanda、miRcode和ENCORI網站預測所結合的miRNA。運用Cytoscape軟件構建mRNA、lncRNA、circRNA-miRNA調控網絡，網絡中共有145個節點(其中含有48個mRNA，10個lncRNA、15個circRNA，72個miRNA)和361條邊。藍色節點代表circRNA，綠色節點代表lncRNA，紫紅色節點代表mRNA，黃色節點代表miRNA，每條邊表示mRNA、lncRNA、circRNA與miRNA的作用關系。在網絡中，一個節點的度表示網絡中與節點相連的路線的條數，根據網絡拓撲學性質選出度值較高的節點，這些節點可能是整個網絡中的關鍵，并發揮著關鍵作用。見圖4。

圖4 lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA調控網絡

2.3靶點通路分析 將上述篩選出的48個差異mRNA通過DAVID數據庫進行GO功能富集分析，共得到GO條目69個，其中生物過程(BP)條目39個，細胞組成(CC)條目7個，分子功能(MF)條目23個(P<0.05)。在BP中，基因主要富集于protein localization to nucleus、positive regulation of phosphoprotein phosphatase activity、positive regulation of phosphatase activity中。在CC中，主要富集在calcium channel complex、host、host cell等中。在MF中，主要富集在phosphatase regulator activity、protein phosphatase activator activity、phosphatase activator activity中。各類別排名前10的GO條目繪制氣泡圖，如圖5所示。KEGG通路富集篩選得到4條信號通路(P<0.05)，涉及Glucagon signaling pathway、Estrogen signaling pathway、Phototransduction、RNA transport。見圖6。

圖5 差異表達mRNA GO富集分析

圖6 差異表達mRNA KEGG富集分析

3 討 論

在臨床上，許多CHD患者早期往往沒有明顯的表現癥狀，而一旦發病，嚴重者則會導致心肌梗死甚至猝死。冠狀動脈造影作為有創性檢查手段，目前仍是診斷CHD的“金標準”。但其在實際運用中，具有一定的局限性。此外，CHD患者還存在藥物不良反應、介入手術費用昂貴、術后再狹窄等方面的問題。因此，進一步對CHD生物標志物及其作用機制的研究顯得尤為重要。

幾乎所有類型的細胞都可以分泌外泌體，目前研究發現的外泌體中所含的核酸包括mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA等。mRNA是一大類RNA分子，種類繁多，它是指導蛋白質生物合成的直接模板〔11〕。miRNA、lncRNA和circRNA是非編碼RNA，已被證實參與了CHD的發病和進展〔12，13〕。miRNA是小的內源性非編碼RNA分子，19～22個核苷酸長度，轉錄后調節基因表達，參與細胞發育、分化、增殖、凋亡和代謝的調控〔14〕。lncRNA存在于細胞核或細胞質中，長度大于200個核苷酸長度，其功能沒有明顯的蛋白質編碼功能，它們可以與DNA，RNA或蛋白質相互作用〔15〕。circRNA來源于單個RNA分子，其末端由共價鍵連接而非5′和3′游離端組成。一些circRNA能與RNA結合蛋白相互作用，調節轉錄，或者被翻譯成蛋白質〔16〕。在心血管組織和器官中，circRNA參與了心肌修復調節、血管平滑肌細胞和心肌纖維化等生理和病理過程〔17〕。lncRNA和circRNA能競爭性結合miRNA，導致miRNA結合的mRNA減少，從而影響蛋白的表達。因此lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA相互作用網絡調控冠心病發生發展過程中關鍵基因的RNA表達。由于外泌體的特殊結構和功能，使得它具有潛在的應用價值，一方面可以作為診斷多種疾病的生物指標，另一方面也可以作為治療手段，未來有可能作為藥物的天然載體用于臨床治療〔18〕。本研究結果提示差異表達下調的hsa_circ_0000038和hsa_circ_0000160；miRNA 3個，分別為hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-363-3p可能是CHD發生發展的關鍵，可作為早期檢測生物標志物在臨床工作中進一步探索。對CHD網絡中差異表達的48個mRNA進行GO和KEGG富集分析，GO生物過程富集分析涉及磷酸蛋白磷酸酶活性的正調節、磷酸酶活性的正調節等。磷酸酶包括酸性磷酸酶和堿性磷酸酶。血清堿性磷酸酶是一種催化血管鈣化抑制劑無機焦磷酸鹽水解的酶，它能通過破壞無機焦磷酸鹽的結構和活性，降低焦磷酸水平，導致血管鈣化，而血管鈣化是冠狀動脈疾病形成的基石〔19〕。相關研究表明〔20，21〕，堿性磷酸酶水平不僅與CHD患者的冠狀動脈鈣化嚴重程度具有相關性，而且還與CHD患者不良預后和死亡率相關。唐恩燕等〔22〕對470例CHD患者進行回顧性分析，發現堿性磷酸酶水平升高可能與冠狀動脈狹窄有關。通過KEGG富集分析顯示，差異表達mRNA主要通過參與胰高血糖素、雌激素和核糖核酸運輸等信號通路作用于CHD。胰高血糖素是一種由胰臟胰島α-細胞分泌的激素，能夠激活脂肪酶，促進脂肪的分解和脂肪酸氧化。在腸黏膜的L細胞中，胰高血糖素原基因的主要表達產物是胰高血糖素樣肽(GLP)-1〔23〕。GLP-1可以通過以下機制影響CHD：①能直接作用于腺苷酸環化酶，導致eNOS和NO釋放，起到抗凝血、抗氧化的作用，從而改善血管內皮功能；②抑制炎癥反應和氧化損傷，從而改善機體動脈粥樣硬化情況；③促進心肌缺血后左心室功能和心肌頓抑的恢復，減少心肌缺血/再灌注所引起的損傷〔24～26〕。雌激素的生理作用主要由雌激素受體(ESR)介導，ESR 分為ESRα和ESRβ兩種亞型，ESRα可以通過抑制CD4+T 淋巴細胞轉移和降低腫瘤壞死因子以及白細胞介素-6 的表達來減輕炎癥反應。雌激素既能通過增加血漿中內皮源性松弛因子NO的濃度來促進血管舒張，也能通過減少血管緊張素轉化酶的轉錄來抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統；此外，還被認為可以調節特定的炎癥標志物和細胞因子〔27，28〕。

CHD歸屬中醫“胸痹”“心痛”范疇。中醫有著數千年的歷史，在理論上獨樹一幟，在臨床上也很豐富。辨證論治和整體觀念是中醫的兩個基本特征。中醫藥在CHD的預防、治療和預后中起著重要作用。然而，中醫藥治療CHD的機制尚未闡明。結合生物信息學分析，認為lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA網絡可能是中醫有效治療CHD的一種新的調節機制。lncRNA和circRNA與miRNA彼此相互作用，以調節CHD發生和發展過程中某些關鍵基因的mRNA表達〔29〕。據相關研究表明〔30〕，中藥具有保護心肌細胞、抗動脈粥樣硬化、抑制細胞凋亡及通過調節miRNA保護心血管系統的作用。因此，中醫藥可以通過影響lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA調控網絡，以輔助CHD的診斷和臨床療效評估。

本研究利用生物信息學技術，篩選出CHD患者外泌體中差異表達的lncRNA、circRNA和mRNA，構建了lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA調控網絡，分析了差異表達mRNA的生物學功能和調控通路，為后期實驗研究提供數據和基礎，也為確定CHD早期診斷標志與中醫藥治療開辟了新的思路。