shRNA沉默軟骨素聚合因子基因對腦膠質瘤細胞活性的影響

吳海濤 陳小忠 趙洪新 申昊 楊朝志 岳翔 張平 王培

(遵義醫科大學附屬醫院神經外科，貴州 遵義 563000)

腦膠質瘤是中樞神經系統發病率最高的惡性腫瘤，具有高增殖性、侵襲性及易復發的特點〔1〕。目前臨床治療以手術聯合放化療為主，但預后較差，患者5年生存率很低〔2〕。雖然腦膠質瘤的發病機制尚未完全明確，但研究者已發現腦膠質瘤屬于多基因異常性疾病〔3〕，原癌基因的高表達和抑癌基因缺失共同導致了腫瘤細胞的異常調控機制〔4〕。軟骨素聚合因子(ChPF)是一種由多種氨基酸構成的跨膜蛋白，在結腸癌、頭部鱗狀細胞癌中存在高表達，且可能介導腫瘤的發生、發展〔5〕。ChPF蛋白在腦膠質瘤組織中表達水平明顯高于正常腦組織〔6〕；本實驗以此為基礎，并結合相關文獻〔7～9〕，推測ChPF高表達可能提升腦膠質瘤細胞活性，其作用機制可能與調控單核細胞趨化蛋白(CCL2)有關。本研究通過重組慢病毒質粒轉染技術下調人腦膠質瘤A172細胞中ChPF表達，觀察對細胞增殖、侵襲的影響，并進一步下調細胞中CCL2表達，探討ChPF對CCL2表達的單向調控機制。

1 對象與方法

1.1主要材料與試劑 人腦膠質瘤細胞系A172購于上海慧穎生物科技有限公司。攜帶綠色熒光蛋白的載體構建ChPF-shRNA及其陰性對照Nc-shRNA重組慢病毒質粒購于博格隆(上海)生物技術有限公司；CCL2-shRNA及其陰性對照Nc-shRNA重組慢病毒質粒購于上海英駿生物技術有限公司；胎牛血清、DMEM培養基購于沃卡威(北京)生物技術有限公司；Lipofectamine 3000購于上海索寶生物科技有限公司；CCK-8、Trizol試劑購于武漢艾美捷科技有限公司；鼠抗人ChPF、CCL2、β-actin單克隆抗體購于上海宇淳生物科技有限公司。

1.2重組慢病毒轉染細胞及驗證 使用攜帶綠色熒光蛋的載體構建的重組慢病毒轉染人腦膠質瘤A172細胞，分為空白對照組、Nc-shRNA組、ChPF-shRNA組。主要步驟為：取對數生長期的A172細胞，按1×106/孔接種于6孔板中，使用含10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養；觀察細胞融合度超過30%時加入慢病毒轉染，繼續培養72 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光蛋白表達情況，計算熒光細胞所占比例，超過80%后進行后續實驗。同時使用RT-PCR和Western印跡檢測細胞中ChPF mRNA和蛋白表達水平，其中RT-PCR的ChPF上游引物序列：5′-GAGGACCATGCACGCAAGG-3′，下游引物序列5′-CCATAAGGTCGTGGTAGGGGC-3′。

1.2.1CCK-8法檢測細胞增殖水平 將3組細胞按1×103/孔接種于96孔板中，每孔含100 μl細胞懸液，設置5個復孔，37℃ 5%CO2濃度的細胞培養箱中培養，采用CCK-8法分別測定培養12 h、24 h、48 h、72 h、96 h的細胞增殖活性，具體為：檢測前2 h每孔鍵入20 μl的CCK-8溶液，常規培養2 h，上酶標儀讀取450 nm處每孔的吸光度值。

1.2.2流式細胞術檢測細胞周期及凋亡水平 75%乙醇固定3組細胞，加入濃度為1 mg/ml的核糖核酸酶(RNase) A溶液300 μl，常規培養40 min，加入碘化丙啶700 μl，混合均勻后在4℃避光環境中染色30 min，上流式細胞儀檢測各細胞周期分布情況。使用上樣緩沖液洗滌3組細胞，重懸后收集沉淀，再使用200 μl緩沖液重懸細胞，滴加10 μl膜聯蛋白(Annexin)Ⅴ-FITC，4℃避光環境中靜置20 min，滴加10 μl碘化丙啶，上流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.2.3Transwell細胞侵襲能力檢測 收集轉染48 h的3組細胞消化，使用不含胎牛血清的DMEM培養基重懸計數。Transwell小室的上室中加入基質膠60 μl，其中基質膠：DMEM培養基=1∶2，37℃條件下聚合成膠；下室中加入含600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基。上室中加入1×105個細胞，37℃ 5%CO2濃度的細胞培養箱中培養24 h，棄去上室培養液，擦去未穿膜細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色10 min，光學顯微鏡下隨機選取10個視野，計數侵襲細胞數。

1.2.4CCL2-shRNA轉染細胞后CCL2、ChPF mRNA和蛋白表達水平 取對數生長期的A172細胞，按1×105/孔接種于6孔板中，常規培養至融合度超過30%時，根據Lipofectamine 3000說明書中的操作方法將CCL2-shRNA、Nc-shRNA轉染細胞，分為空白對照組、Nc-shRNA組、CCL2-shRNA組，并收集轉染36 h后的細胞，使用RT-PCR和Western印跡檢測細胞中CCL2、ChPF mRNA和蛋白表達水平，其中CCL2上游引物序列：5′-CCACTGACCCCGTAACTAA-3′，下游5′-GTTCGTCTTCACCCAAGTCC-3′。

1.3統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1轉染后各組ChPF mRNA和蛋白表達情況 ChPF-shRNA轉染人腦膠質瘤A172細胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察可見多數細胞中存在綠色熒光，與背景反差強烈，熒光著色細胞輪廓明顯，說明ChPF-shRNA轉染效率高；見圖1。ChPF-shRNA組ChPF mRNA和蛋白相對表達量明顯低于空白對照組和Nc-shRNA組(P<0.01)；ChPF mRNA和蛋白相對表達量在空白對照組與Nc-shRNA組中差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。

圖1 ChPF-shRNA轉染人腦膠質瘤A172細胞72 h(×400)

表1 各組ChPF mRNA和蛋白表達比較

圖2 Western印跡檢測ChPF蛋白表達

2.2各組細胞增殖能力比較 與空白對照組、Nc-shRNA組相比，ChPF-shRNA組細胞增殖能力明顯減弱，48 h、72 h、96 h時，差異有統計學意義(P<0.05)；空白對照組與Nc-shRNA組細胞增殖能力之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3各組細胞周期及凋亡率比較 ChPF-shRNA組S期、G2/M期的細胞比例明顯低于空白對照組、Nc-shRNA組，G0/G1期的細胞比例明顯高于空白對照組、Nc-shRNA組，差異有統計學意義(P<0.05)；空白對照組與Nc-shRNA組各細胞周期的細胞比例之間差異無統計學意義(P>0.05)。ChPF-shRNA組細胞凋亡率明顯高于空白對照組、Nc-shRNA組，差異有統計學意義(P<0.01)；空白對照組與Nc-shRNA組細胞凋亡率之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組培養不同時間細胞增殖能力比較(OD值，

表3 各組人腦膠質瘤A172細胞周期及凋亡率比較

2.4各組細胞侵襲能力比較 空白對照組、Nc-shRNA組、ChPF-shRNA組穿過小室膜的細胞數分別為(35.61±5.08)個、(34.38±4.62)個、(15.97±2.69)個。ChPF-shRNA組穿過小室膜的細胞數明顯少于空白對照組、Nc-shRNA組，差異有統計學意義(P<0.01)；空白對照組與Nc-shRNA組穿過小室膜的細胞數差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 Transwell小室檢測各組人腦膠質瘤A172細胞侵襲能力(×200)

2.5各組CCL2 mRNA和蛋白表達情況比較 ChPF-shRNA組人腦膠質瘤A172細胞CCL2 mRNA和蛋白相對表達量明顯低于空白對照組與Nc-shRNA組，差異有統計學意義(P<0.01)；空白對照組與Nc-shRNA組CCL2 mRNA和蛋白相對表達量之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖4。

2.6轉染CCL2-shRNA后對人腦膠質瘤A172細胞中ChPF mRNA和蛋白表達 CCL2-shRNA組CCL2 mRNA和蛋白相對表達量明顯低于空白對照組與Nc-shRNA組，差異有統計學意義(P<0.01)；空白對照組與Nc-shRNA組CCL2 mRNA和蛋白相對表達量之間差異無統計學意義(P>0.05)。ChPF mRNA和蛋白相對表達量在各組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表5、圖5。

表4 各組CCL2 mRNA和蛋白表達比較

圖4 Western印跡檢測CCL2蛋白表達

表5 各組人腦膠質瘤A172細胞CCL2及 ChPF mRNA和蛋白表達比較

圖5 Western印跡檢測人腦膠質瘤A172細胞中CCL2及ChPF mRNA和蛋白表達

3 討 論

腦膠質瘤惡性程度高、治療預后差，且發病機制目前仍未完全明確，但基因水平的變異被公認為膠質瘤發生的根本原因之一，膠質瘤基因水平治療也受到了廣泛關注〔10〕。ChPF是人軟骨素合成酶生成硫酸軟骨素的必要輔助因子，硫酸軟骨素廣泛分布于人體多個組織中，與腦神經發育、感染、炎癥反應密切相關〔11〕，同時還能夠抑制脊髓受損后神經軸突的再生〔12〕。提示ChPF可能通過調節人體細胞的分化，介導相關疾病的發生與發展。相關研究顯示，結直腸癌組織中存在ChPF高表達，且ChPF表達水平與腫瘤分級呈正相關〔13〕；進一步研究發現，ChPF能夠介導結直腸癌組織中軟骨素合成，在結腸癌中主要發揮促癌因子作用〔14〕。研究發現，腦膠質瘤組織中ChPF表達水平明顯高于正常腦組織〔15〕，提示腦膠質瘤組織中存在ChPF高表達。在此基礎上，本研究使用ChPF-shRNA轉染人腦膠質瘤A172細胞，經ChPF mRNA和蛋白檢測顯示細胞中ChPF表達被明顯抑制，提示轉染成功。CCK-8檢測顯示，ChPF表達下調后細胞增殖能力被明顯抑制；進一步分析細胞周期及凋亡情況顯示，ChPF表達下調后G0/G1期細胞數量明顯提升，提示細胞增殖受限，且細胞凋亡比例明顯增加。Transwell小室實驗顯示，抑制ChPF表達能夠有效降低人腦膠質瘤A172細胞的侵襲能力。上述研究結果表明，ChPF表達下調后，人腦膠質瘤A172細胞的增殖、侵襲能力被抑制，凋亡水平提升。

研究者利用基因芯片技術研究分析發現，敲除ChPF基因表達后糖皮質激素信號通路受到明顯影響，其中對CCL2的影響最為顯著〔16〕。近年來研究發現，糖皮質激素受體能夠通過調控炎癥反應，介導腫瘤的發生、發展〔17〕。如乳腺癌患者體內糖皮質激素受體信號能夠激活核轉錄因子(NK)-κB，促進腫瘤細胞的增殖與轉移〔18〕。CCL2屬于促炎癥因子，能夠促進腫瘤細胞聚集相關巨噬細胞，作為趨化因子促進腫瘤發生與發展〔19〕。研究證實，炎性微環境能夠促進腫瘤細胞的增殖與轉化，已被用于抑制腫瘤細胞生長的治療性實驗〔20，21〕。本研究顯示，抑制ChPF表達后，人腦膠質瘤A172細胞中CCL2 mRNA和蛋白相對表達量明顯下降；但抑制CCL2表達后，ChPF mRNA和蛋白表達水平未出現明顯改變；提示ChPF對CCL2表達具有單向調控作用，ChPF可能通過調控CCL2表達來影響人腦膠質瘤細胞活性。