附子中生物堿檢測(cè)方法研究進(jìn)展

◎阮世勇，戴 潔，孫志勝，馮 濤

（陽(yáng)江市檢測(cè)檢驗(yàn)中心，廣東 陽(yáng)江 529500）

附子是毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaeli）的子根加工品，主產(chǎn)于四川、陜西、湖北、湖南和云南等地，為有毒中藥，曾有附子使用引發(fā)食物中毒的報(bào)道[1]。附子性味辛、甘、大熱，有回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛的功效[2]，為我國(guó)中醫(yī)常用藥，但因其毒性，在臨床上常需炮制、配伍減毒后使用[3]。附子中化學(xué)成分多樣，其有效化學(xué)成分主要是烏頭類(lèi)生物堿，此外還有阿樸啡型、酰胺型、季銨鹽型等類(lèi)型的生物堿[4-5]，其檢測(cè)方法有薄層色譜法、酸堿中和法、分光光度法、離子選擇電極法、薄層掃描法、高效毛細(xì)管電泳法、液相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。本文對(duì)附子中化學(xué)成分及其檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，為附子引起的食物中毒檢測(cè)提供指導(dǎo)，促進(jìn)附子藥材安全使用。

1 附子中的生物堿

附子中生物堿的含量很高，且多數(shù)結(jié)構(gòu)已確定，其中以烏頭類(lèi)生物堿為主。從附子中鑒定出的生物堿達(dá)100 余種，其生物堿的類(lèi)型以C19型二萜生物堿為主[6]；其次是C20型；還有阿樸啡型、酰胺型、季銨鹽型等類(lèi)型的生物堿[7]。C19型二萜生物堿以烏頭堿骨架為主，該類(lèi)生物堿是目前發(fā)現(xiàn)化合物數(shù)量最多也是最具毒性的植物成分之一。此外還有牛扁堿型（lycoctine）C20二萜生物堿aconicarchamine A、yokonoside、去甲烏藥堿、季銨鹽coryneine chloride、去甲豬毛菜堿、附子亭、吡咯生物堿及一種全新的阿樸啡生物堿。

2 附子中生物堿檢測(cè)方法

2.1 總生物堿的含量測(cè)定

（1）酸堿中和法。可用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液直接滴定，也可采用先加定量酸液和指示劑再用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液回滴定。由于直接滴定法變色終點(diǎn)不明顯，多采用回滴定法，常用指示劑為甲基紅，標(biāo)準(zhǔn)堿為氫氧化鈉，滴定終點(diǎn)為黃色，可用于檢測(cè)不同炮制方法對(duì)附子總生物堿含量影響的動(dòng)態(tài)影響情況[8]，以及不同處理時(shí)間對(duì)附子總生物堿的影響[9]。該方法簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確性穩(wěn)定性較理想，但靈敏度低，所需要的樣品量大。

（2）分光光度法。利用生物堿與酸性染料溴甲酚綠、溴麝香草酚藍(lán)等在一定pH 條件下絡(luò)和生成有色化合物后進(jìn)行比色測(cè)定的方法。該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，易于推廣。龍沛霞等[10]采用一階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定制川烏、制草烏及附子中烏頭生物堿含量，測(cè)得結(jié)果與《中國(guó)藥典》（1995年版）方法的測(cè)定結(jié)果比較無(wú)顯著差異，且操作起來(lái)更簡(jiǎn)便。

（3）離子選擇電極法。該法是利用四苯硼-烏頭類(lèi)生物堿活性物質(zhì)研制的電化學(xué)檢測(cè)器，其電極電位在烏頭類(lèi)生物堿一定的濃度范圍內(nèi)符合Nernst 方程，可建立起相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，從而直接對(duì)烏頭類(lèi)生物堿進(jìn)行定量測(cè)定。此法選擇性高，不需要內(nèi)參比電極和內(nèi)參比溶液，成本低廉，制作簡(jiǎn)單，使用方便。

2.2 單個(gè)生物堿的含量測(cè)定

（1）氣相色譜法。氣相色譜作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的檢測(cè)儀器，對(duì)易揮發(fā)性組分的檢測(cè)具有優(yōu)勢(shì)，能對(duì)樣品中多組分的比例進(jìn)行分析。靈敏度滿(mǎn)足常量及微量的要求，可用于附子中易揮發(fā)性組分的檢測(cè)。張聿梅等[11]采用氣相色譜法測(cè)定了風(fēng)濕骨痛酒中的酯型烏頭堿含量，平均回收率為98.4%。樣品用量少，可用于附子及其復(fù)方制劑中酯型生物堿含量的測(cè)定。

（2）高效液相色譜法。高效液相色譜法具有高速、高靈敏度、高分辨度等優(yōu)點(diǎn)，因其測(cè)定成分多、結(jié)果準(zhǔn)確而極受歡迎。附子中的生物堿極性較強(qiáng)，比較適合用高效液相色譜分析[12]。紫外檢測(cè)器是高效液相色譜最常用的檢測(cè)器，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、線(xiàn)形范圍廣等特點(diǎn)，但只適用于具有紫外吸收的烏頭類(lèi)生物堿的含量測(cè)定，可同時(shí)測(cè)定6 種烏頭類(lèi)生物堿的含量。

（3）高效毛細(xì)管電泳法。中藥及其制劑成分復(fù)雜，其中親水性成分的定量分析比較困難。高效毛細(xì)管電泳法是近十幾年發(fā)展起來(lái)的一種高效分離分析技術(shù)[13]，具有分離模式多、量微、快速、溶劑消耗少、柱子便宜和易于清洗等優(yōu)點(diǎn)，適合無(wú)機(jī)離子和小分子化合物的分析測(cè)定。韓樂(lè)[14]等人建立的高效毛細(xì)管電泳法能同時(shí)測(cè)定附子中6 種生物堿，線(xiàn)性關(guān)系良好（r＞0.999 7），加標(biāo)回收率為95.25%～103.91%，檢出限為1.16～3.06 μg·mL-1，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的需求。與高效液相色譜法相比，高效毛細(xì)管電泳法具有分析時(shí)間短、雜質(zhì)干擾少、使用有機(jī)溶劑少、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有應(yīng)用前景的分析方法。

（4）液質(zhì)聯(lián)用。液質(zhì)聯(lián)用儀具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)檢驗(yàn)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，能應(yīng)對(duì)痕量樣本的檢測(cè)，多采用ESI 軟電離的方式進(jìn)行樣品的離子化，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描方式測(cè)定[15]。該測(cè)定方法集合了液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度和極強(qiáng)的定性專(zhuān)屬性于一體，能對(duì)烏頭堿水解產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，確定生物堿的結(jié)構(gòu)類(lèi)型等，適用于中藥及其制品體內(nèi)代謝化學(xué)的研究及食物中毒樣本的快速測(cè)定。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將成為分析方法新的方向。

3 結(jié)語(yǔ)

附子中主要有效化學(xué)成分為烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等化學(xué)、雙酯型生物堿，在附子生物堿的含量測(cè)定上，氣相色譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、液質(zhì)聯(lián)用儀等各種分析方法均有自身特點(diǎn)，化學(xué)方法適用于生物堿總量的測(cè)定，氣相、液相等儀器分析方法適用于單一組分的分析。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇，質(zhì)譜聯(lián)用法有著高靈敏度、高選擇性、高抗干擾能力，是未來(lái)附子化學(xué)成分檢測(cè)的發(fā)展方向。