Bcl-2、Bax、Fas 在大腸癌脾胃虛弱證病人舌苔脫落細胞表達及其相關性研究

海 日，師建平，趙 敏，張 鎖，榮寶山，黨 贏，焦雨琦，李月煒，包領芝

（內蒙古醫科大學中醫學院，內蒙古 呼和浩特 010059）

大腸癌，是消化道常見惡性腫瘤。流行病學調查顯示，其發病率依性別差異，位列世界惡性腫瘤譜的2、3 位[1]（女性男性分別排2、3 位）。近年癌證與舌苔脫落細胞相關的理化性質、蛋白表達、基因檢測等研究屢見不鮮。中醫舌象之所以與現代醫學所研究的舌苔脫落細胞相關，是因為正常的薄潤舌苔，在細胞層面上，由及時脫落的舌角化層細胞堆積而成。形成舌苔的過程，涉及細胞的凋亡，即形成了舌苔脫落細胞。舌苔脫落細胞，由鱗、柱狀上皮細胞等舌上皮細胞，及紅、白細胞等非上皮細胞組成。舌上皮細胞的正常細胞增殖過程及穩定的口腔pH 值，是正常薄白苔的關鍵。中醫所講的正常舌象是淡紅舌，薄白苔。而舌象，直觀的反映于舌質及舌苔，古人稱其為脾胃的“探針”，故中醫認為消化系統的疾病變化可經舌象體現出來。而眾多現代醫學研究者認為，若細胞增殖紊亂、代謝異常等細胞活性的改變可影響角化層細胞脫落延遲亦或使角化不全，細胞脫落受阻，細胞大量堆積于舌面，形成厚苔。

近年來，現代醫學的研究者從血清腫瘤標志物、蛋白表達、基因等層面對大腸癌進行了研究，盡管研究如此多樣化，但其與中醫的研究缺乏關聯性[2]。中醫學者從病因病機方面對大腸癌進行了深入研究，認為該病病位雖在大腸，但隨著病情進展，病邪可累及脾胃、肝、腎等臟腑。研究認為，大腸癌的主要病機是“脾虛”[3，4]，脾虛即后天之本失充，食物精微化生乏源，水谷精微不升反降，困為濁邪，下迫腸腑，加之正氣不足，合而發病。故本課題選取則之“脾虛”的大腸癌脾胃虛弱證。以中醫舌診為立足點，借助現代實驗方法，應用舌苔脫落細胞，對大腸癌脾胃虛弱證病人的舌苔脫落細胞進行研究，探索抑制凋亡蛋白Bcl-2、促進凋亡蛋白Bax、Fas 表達水平與大腸癌的關聯性，為大腸癌的早期篩查提供參考，也為中醫客觀化研究提供實驗支撐，進而更好地為臨床服務。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017-03～2017-11 期間就診于我校一附院的病人。其中大腸癌組最終入組的60例病人，經由結直腸癌術后，且無癌細胞轉移的，中醫辨證為大腸癌脾胃虛弱證的，年齡分布在40～73 歲區間，平均57.40 歲。非癌組的20 例，均為檢查后排除大腸癌，經辨證為脾胃虛弱證的其他腸道疾病病人，年齡分布在26～70 歲區間，平均51.40 歲。選擇同期來醫院體檢的健康人20 例，年齡分布在29～62歲區間，平均49.35 歲，記為正常對照組。各組年齡、性別構成比例無顯著性差異。

1.2 主要試劑和儀器

Bcl-2 抗體（bs-0032R），Bax 抗體（bs-4564R），Fas抗體（bs-0215R），液基細胞保存液，95%乙醇，二甲苯，DAB顯色試劑盒，SP試劑盒，液基細胞超薄制片機，光學顯微鏡等。

1.3 實驗方法

用一次性壓舌板，刮取舌中部舌苔，后存于液基細胞保存液中，再經制片，制得玻片標本。對標本采用免疫組化法處理，步驟簡述如下：固定→水化→孵育→加A液→抗原修復→加B液→一抗孵育→加C液→加D液→顯色→復染→脫水→封片→結果判定。其中，陰性對照組采用PBS 緩沖液代替一抗，其他步驟及方法不變[5]（見圖4）。光鏡下（400倍鏡）觀察Bcl-2、Bax、Fas三種蛋白的表達情況。

1.4 結果判定

在光鏡下，Bcl-2、Bax、Fas蛋白的陽性表達為細胞漿和或細胞膜附著棕色或栗色，陰性表達為細胞漿和或細胞膜附著紫色。在參照Reimer[6]實驗判斷標準的基礎上，將本實驗的結果判定標準定為，Bcl-2、Bax、Fas 蛋白的陽性細胞數＞10%為陽性（+），≤10%為陰性（-）。注：每張玻片隨機取5 個視野觀察，綜合判別。

1.5 統計學處理

采用Excel 整理數據，采用SPSS 20.0 進行統計分析和統計描述。計量資料的統計描述采用均數±標準差或中位數（四分位間距）表示。計數資料的統計描述采用率或構成比表示，多組間的比較采用行×列表卡方檢驗。P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 三組間Bcl-2表達的比較

大腸癌組病人舌苔脫落細胞Bcl-2 蛋白的陽性表達顯著高于其他兩組，各組間Bcl-2 蛋白的表達有統計學差異（P＜0.05）（見表1）。

表1 三組間Bcl-2表達的比較

2.2 三組間Bax表達的比較

大腸癌組病人舌苔脫落細胞Bax蛋白的陽性表達顯著低于其他兩組，各組間Bax 蛋白的表達有統計學差異（析P＜0.05）。這可能是具同源性的，同屬Bcl-2基因家族的，Bax蛋白和Bcl-2蛋白，效應相悖的表現（見表2）。

表2 三組間Bax表達的比較

2.3 三組間Fas表達的比較

大腸癌組、非癌組、正常對照組中，Fas 蛋白的陽性表達差異不大，尚不能認為各組間Fas 的表達有統計學差異（P＞0.05）（見表3）。

表3 三組間Fas表達的比較

圖1 Bcl-2陽性大腸癌組（×400）

圖2 Bax陽性大腸癌組（×400）

圖3 Fas陽性大腸癌組（×400）

圖4 PBS免疫組化陰性對照（×400）

3 討論

3.1 舌象特征

舌診，是中醫學的特色診法之一，亦為中醫診斷學的重要內容之一，傳統醫學認為，望舌即望舌質和望舌苔。從現代醫學的解剖位置上講，舌與胃腸相通，故胃腸疾患可以很好的反映于舌，舌象又通過司外揣內以探知胃腸的情況。故而，本課題研究發現，大腸癌組的舌象特征為淡白舌，膩苔。我認為形成此舌象的原因可能是本組病患脾胃兩虛，后天之本失充，食物化生乏源，舌體缺乏充養，故舌色淺淡。又因病變本身的疫癘邪氣凝集于腸腑，術后病人病灶已除，痰、火、瘀、毒等有形實邪不復，故舌色只比正常舌色淺淡。正如古人所講：“脾胃為中土，邪入胃則生苔，如地上生草也”。膩苔，理論上講為濕濁痰邪停聚、陽氣被遏。本組病患脾胃虛弱，膩苔則可能由邪氣阻滯腸腑，手術傷及陽氣至其升散不及所致。

3.2 相關蛋白檢測指標

研究結果顯示，各組間Bcl-2 蛋白的表達有統計學差異。細胞凋亡是逐漸被人類認識到的，由多基因調控、多種酶介導的，不同于細胞壞死的一種細胞死亡。在大腸癌組，大腸癌病人舌苔脫落細胞的凋亡途徑中，抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax結合，形成穩定的異二聚體，以抑制Bax 蛋白的活性。而在標本中，過量表達的Bcl-2蛋白，介導抑制細胞 DNA 的斷裂[7，8]，以使凋亡受抑制，從而延長細胞的生命周期，保護細胞以達到永久存活的目的，故大腸癌組的Bcl-2 蛋白表達量較高（見圖1）。有文獻報道[9]，Bcl-2 蛋白的陽性表達率與癌癥的轉移、多藥耐藥及臨床病例分期有關。

研究結果顯示，各組間Bax 蛋白的表達有統計學差異。現代研究認為，Bax、Bcl-2 兩種蛋白，通過拮抗作用對腫瘤的發生發展起重要作用，但與基因調控不同的是，Bax、Bcl-2 蛋白通過調控凋亡途徑，以調節腫瘤細胞[10]，亦可維持正常細胞的周期。這兩個凋亡調控蛋白通過線粒體途徑發生作用，正常的健康細胞中Bax 蛋白以無生物活性形式存在，此時不能被Bcl-2抑制性結合。當細胞接收到凋亡信號，Bax蛋白釋放一種物質，這種具有生物活性的物質，能通過改變線粒體外膜通透性，促進細胞凋亡的發生[11，12]。舌苔脫落細胞受到凋亡信號刺激后，Bax蛋白與高表達的Bcl-2蛋白結合，形成穩定的異二聚體，使得細胞凋亡被抑制，延長細胞生存期，細胞不能凋亡脫落。故Bax蛋白在大腸癌組病人舌苔脫落細胞中呈現低表達（見圖2）。

實驗所得大腸癌組病人的舌苔脫落細胞的Fas蛋白陽性表達（見圖3），尚不能認為各組間Fas的表達有統計學差異。分析其原因：首先，參考的研究標本是歸屬組織學的大腸癌組織，本課題的研究標本則是歸屬細胞學的舌苔脫落細胞，這可能是形成Fas 表達差異的原因；其次，本課題研究范圍小、樣本少，可能是造成統計學差異的原因。Fas 蛋白在正常健康人的組織細胞中也有陽性表達，當陽性表達量的增加到一定程度時，Fas 系統開始誘導凋亡。研究顯示[13]Fas 在大腸癌組織細胞中表達下調，這是由于腫瘤細胞的惡性增殖使細胞凋亡減少，基因調控抑制死亡受體的表達。

4 總結

綜上，本文通過觀察大腸癌脾胃虛弱證病人舌象特征及檢測舌苔脫落細胞凋亡，發現大腸癌組的舌象特征為淡白舌、膩苔。在舌苔脫落細胞凋亡蛋白中，大腸癌組病人由于疾病病理病性等因素的影響，舌苔細胞凋亡受到抑制，使得Bcl-2 蛋白高表達，Bax 蛋白低表達。這種由于細胞凋亡與增殖失衡狀態下一系列基因和多酶介導的細胞內環境變化而引發的惡變，可能是癌癥發生發展的原因。本課題將中醫舌診與現代化的西醫檢測手段結合起來，為中醫舌診與大腸癌之間的關聯性提供客觀化實驗依據。