豌豆根際土壤中細(xì)菌的鑒定及其對(duì)黃豆幼苗促生作用研究

張偉 王加順 郭文濤 梁福平 周曉倫

(甘肅醫(yī)學(xué)院，甘肅 平?jīng)?744000)

植物促生菌是一類自由生活在土壤或根系周圍的有益微生物,植物促生菌能通過(guò)產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素如IAA,促進(jìn)植物根系中側(cè)根和不定根的生長(zhǎng),從而促進(jìn)植物對(duì)環(huán)境中礦物元素和營(yíng)養(yǎng)的吸收[1]；通過(guò)產(chǎn)生ACC 脫氨酶能降低乙烯的前體物質(zhì)ACC 的濃度,從而降低植物逆境脅迫(旱澇、重金屬脅迫、高鹽環(huán)境等) 下乙烯的濃度水平[2]。從污染的土壤中原位分離土著植物促生菌強(qiáng)化植物修復(fù),不僅使本土物種能夠更好地適應(yīng)當(dāng)?shù)靥囟ōh(huán)境,而且能夠盡量避免非本土化的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[3]。通過(guò)測(cè)定菌株的促生特性(IAA、ACC 脫氨酶活性),進(jìn)一步挑選具有較好促生能力的菌株,結(jié)合16S rDNA 序列分析和生理生化試驗(yàn)結(jié)果鑒定細(xì)菌種屬,以期得到一批優(yōu)良的土著植物促生菌。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土壤采集

樣品采集于甘肅省平?jīng)鍪胁転炒?E106.90281°、N35.486647°) 大田農(nóng)作物豌豆根際土壤。

1.1.2 主要材料化學(xué)藥品等級(jí)均為分析純,由西安姚北生物科技有限公司提供。黃豆種子為農(nóng)家精選優(yōu)良品種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根際土壤細(xì)菌的分離

準(zhǔn)確稱取3 份土壤各10g,分別加入盛有90mL 無(wú)菌水(含有20～30 個(gè)玻璃珠) 的錐形瓶中,置振蕩器上振蕩15min,得到10-1濃度的土壤稀釋液,連續(xù)稀釋至10-11,將10-1～10-11梯度的土壤稀釋液均勻地涂布于含有50mg·L-1Cr6+的LB 培養(yǎng)基中,35±2℃倒置培養(yǎng)3～5d。挑取形態(tài)特征不同的菌落劃線在LB 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),每種菌株連續(xù)純化分離3 代以上,最終使平板上的菌落形態(tài)和鏡檢的菌體形態(tài)一樣,將純化的菌落劃線至牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面,4℃保藏,以備后續(xù)研究。

1.2.2 菌株的鑒定

菌株的形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》 方法[4]進(jìn)行。

1.2.3 菌株16S rDNA 序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將S70 菌株的16S rDNA 序列,通過(guò)NCBI 網(wǎng)站錄入,與已知的序列對(duì)比并分析同源性,利用DNASTAR (MegAlign) 將序列進(jìn)行對(duì)位排列,利用MEGA5.1 分子進(jìn)化遺傳分析軟件分析堿基組成、GC含量,利用Kimura2 參數(shù)計(jì)算遺傳距離,采用NJ 鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株ACC 脫氨酶測(cè)定

ACC 脫氨酶分解ACC 產(chǎn)生的α-酮丁酸用來(lái)測(cè)定ACC 脫氨酶活性,參照Penrose 等的方法測(cè)定α-酮丁酸含量[5]。根據(jù)Bradford 方法測(cè)定菌體蛋白含量[6]。根據(jù)α-酮丁酸和蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定ACC 脫氨酶活性。

1.2.5 菌株IAA 的測(cè)定

將S70 菌株挑1 環(huán)到含有20mL 微量蔗糖鹽液體(SMS) 培養(yǎng)基的錐形瓶中28℃、140r·min-1培養(yǎng)96h,液體培養(yǎng)基中加入0.5mg·mL-1的色氨酸。取1.5mL 懸浮液到2mL 離心管中5000g 離心15min,取上清液1mL 到5mL 比色管中,加入2mL Salkowski's溶液,振蕩混勻室溫靜置20min,比色管中溶液會(huì)出現(xiàn)粉紅色,在530nm 檢測(cè)粉紅色物質(zhì)的吸光度[7]。1個(gè)菌株做3 個(gè)重復(fù),根據(jù)IAA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定菌株產(chǎn)IAA 能力大小。

1.2.6 菌株對(duì)黃豆幼苗生長(zhǎng)的影響

采用改良的Belimov 等的方法確定根際細(xì)菌的植物促生根長(zhǎng)活性[8]。接種18 株菌株至6mL LB 液體培養(yǎng)基中28℃、180r·min-1培養(yǎng)24h,用無(wú)菌水懸浮菌體數(shù)為5×107CFU·mL-1。1mL 細(xì)菌懸浮液或無(wú)菌水(未處理的對(duì)照組) 加入到含有40mL Hoagland 半固體培養(yǎng)基試管中(內(nèi)徑30mm)[9]。用3%H2O2和95%乙醇(體積比為1：1) 對(duì)黃豆幼苗表面滅菌2min,無(wú)菌水沖洗數(shù)次至種子表面無(wú)氣泡產(chǎn)生,挑選優(yōu)良種子到Hoagland 半固體培養(yǎng)基,所有的試驗(yàn)處理組做3次重復(fù)。在光照培養(yǎng)箱中28℃黑暗培養(yǎng)21d,培養(yǎng)后測(cè)量黃豆幼苗的根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、葉面積、鮮質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌體形態(tài)和革蘭氏染色

分離出的18 種菌株中,有8 種菌株革蘭氏染色為陰性,其余11 種菌株革蘭氏染色為陽(yáng)性,見(jiàn)表1。菌體細(xì)胞形態(tài)有桿狀和球狀2 種,有8 種菌株菌體形態(tài)為桿狀,其余11 種菌株菌體形態(tài)為球狀。

2.1.2 生理生化特性

生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明,見(jiàn)表2,18 株都具有甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性,V.P 試驗(yàn)全部陰性,表現(xiàn)一定的相似性,其余14 項(xiàng)生理生化反應(yīng)結(jié)果各有所不同,菌株間表現(xiàn)差異較大。根據(jù)菌體的形態(tài)特征和生理生化,菌株S3為Acinetobacter sp.；菌株S5 為Exiguobacterium sp.；菌株W6 為Eromonas sp.；菌株D3 為Sireptococcussp.；菌株W9 為 Syntrophococcussp.；菌株S70 為Exiguobacterium sp.；菌株W3 為Bradyrhizobiumsp.；菌株D2 為Megasphaerasp.；菌株W1 為Enterobacteriaceaesp.；菌株D7 為Brachybacteriumsp.；菌株W7 為L(zhǎng)actobacillussp.；菌株S7 為Micrococcussp.；菌株W5 為Enterococcussp.；菌株D4-1 為Enterococcussp.；菌株D6為Megasphaerasp.；菌株W4 為Beijerinckiasp.；菌株S8 為Corynebacteriumsp.；菌株S4 為Megasphaerasp.。

表1 菌株革蘭氏染色及菌體形態(tài)特征

2.1.3 S70 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)菌體形態(tài)特征和生理生化,菌株S70 為Exiguobacterium sp.,為了證實(shí)這一點(diǎn),菌株的分子鑒定通過(guò)16S rDNA 基因測(cè)序和基因Blast 比對(duì)。由圖1 可知,菌株S70 與Exiguobacterium 具有密切的同源性。為了確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育位置,使用NCBI 獲得的序列及MEGA5.10 軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 18 株菌的生理生化特性

2.1.4 S70 菌株產(chǎn)IAA 能力測(cè)定和ACC 脫氨酶活性

通過(guò)ACC 脫氨酶降解乙烯的直接前體ACC 來(lái)降低植物體內(nèi)乙烯的含量,從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[10]。植物促生菌也通過(guò)合成IAA 的方式促進(jìn)植物的生長(zhǎng),IAA 直接刺激植物細(xì)胞的延生和分裂或者提高植物自身的防御系統(tǒng)[11]。S70 具有較高的產(chǎn)IAA 能力和ACC 脫氨酶活性,如表3 所示。

表3 菌株S70 的植物促生物質(zhì)

2.1.5 18 種菌株對(duì)黃豆幼苗生長(zhǎng)的影響

接種18 株菌株的黃豆幼苗的根長(zhǎng)、葉面積結(jié)果表明,相對(duì)于未接種菌株的對(duì)照組,接種18 株菌株都有利于植物根和葉面積的生長(zhǎng)；而接種S70 菌株的玉米幼苗根長(zhǎng)、葉面積、莖長(zhǎng)、鮮重量與對(duì)照組相比更加顯著,如表4 所示。

表4 18 株菌株對(duì)黃豆幼苗生長(zhǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

本研究主要利用16S rDNA 序列分析和生理生化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)體系,從豌豆根際土壤中分離、純化出18株細(xì)菌,進(jìn)一步說(shuō)明植物根際土壤中細(xì)菌分布的廣泛性,對(duì)現(xiàn)有理論關(guān)于細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分析的研究和對(duì)豆科農(nóng)作物的增產(chǎn)具有重要作用。通過(guò)對(duì)這18 株菌的菌體形態(tài)描述和生理生化試驗(yàn),初步鑒定其分屬于不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、單胞菌屬 (Eromonas)、鏈球菌屬 (Sireptococcus)、互營(yíng)球菌屬 (Syntrophococcus)、微球菌屬(Micrococcus)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、巨球型菌屬 (Megasphaera)、腸桿菌屬 (Enterobacteriaceae)、短狀桿菌屬 (Brachybacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、拜葉林克氏菌屬 (Beijerinckia)、棒狀桿菌屬 (Corynebacterium)。

豌豆根際土壤中分離篩選的18 株菌大多能表現(xiàn)出良好的促植物生長(zhǎng)特性,與對(duì)照組相比,促進(jìn)根長(zhǎng)的菌株有S5、S70、D7、W6、S7、D6、W4、S4,分別增加51.24%、56.81%、54.89%、19.76%、58.15%、13.05%、20.72%、26.29%；促進(jìn)莖長(zhǎng)的菌株有W9、S5、S70、W3、D2、W1、D7、W7、W6、S7、W5、D4-1、D6、S4,分別增加25.46%、22.98%、48.44%、31.05%、23.60%、8.69%、3.10%、4.96%、30.43%、4.34%、15.52%、24.84%、22.36%、4.96%；促進(jìn)葉面積的菌株有W9、S5、S70、S3、D7、W6、S4,分別增加2.22%、11.55%、33.33%、30.66%、6.00%、25.77%、53.55%；促進(jìn)鮮重量的菌株有D3、S70、W3、D2、W1、S3、D7、W6、S7、W5、D4-1、D6、W4,分別增加38.51%、51.11%、65.18%、10.37%、76.29%、34.07%、30.37%、47.40%、8.14%、85.18%、11.11%、7.40%、55.55%。還有具有ACC 脫氨酶、產(chǎn)生IAA 等。對(duì)其進(jìn)行促生特性測(cè)定,篩選出了菌株S70,能夠顯著促進(jìn)黃豆幼苗期高生長(zhǎng)和生物量的積累。Bharti 等研究了2 種耐鹽PGPR,Bacillus pumilus STR2 和深海細(xì)菌(Exiguobacteriumoxidotolerans) STR36,其中從鹽堿土植物根際分離到的E.oxidotoleransSTR36菌株能夠分泌豐富的胞外多糖,緩解高鹽對(duì)植物體的脅迫,在原生鹽堿土、次生鹽堿土中接種Exiguobacteriumoxidotolerans STR36 的婆羅米植株生物量比未接菌分別高出109%、138%；植物體中活性物質(zhì)三萜皂苷假馬齒莧皂苷含量比未接菌植株分別高出36%、76%[12]。周曉倫等研究了在不同Cr6+濃度下接種了Exiguobacteriumsp S2 的玉米幼苗與對(duì)照組相比根長(zhǎng)、葉面積、莖長(zhǎng)都有顯著提高,其顯著提高了玉米幼苗對(duì)Cr6+的耐受性[13]。當(dāng)存在微小桿菌時(shí),能夠維持黃豆幼苗根長(zhǎng)、葉面積、莖長(zhǎng)的生長(zhǎng),微小桿菌可以推薦用來(lái)增加植物的生物量。Exiguobacteriumsp.分布廣泛,生存環(huán)境多樣,對(duì)植物促生作用極具實(shí)用價(jià)值。