白藜蘆醇對多柔比星引起的心臟毒性保護作用研究進展

吳文英，李文娟，李 露，尹術華，趙文輝，姚于飛,

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330006）

邁入21世紀，由于食品供給的富余，疾病模式已發生轉變，心血管疾病和腫瘤已經成為危害全球健康的主要疾病[1]。值得注意的是，相比于普通健康人群，有心血管既往病史和家族史的患者，腫瘤發生的風險更高[2]。眾所周知，手術、化療和放療作為腫瘤治療的三大“常規武器”，在抑制/殺死腫瘤細胞的同時，也存在對患者正常細胞損傷的不良反應，導致腫瘤臨床治療風險高、患者預后差[3]。多柔比星（doxorubicin，DOX）是典型的廣譜高效抗腫瘤藥物。DOX與心肌組織的親和力明顯高于其他組織，導致其在心肌細胞中積聚，呈現劑量依賴性的靶向心肌毒性，這極大地限制了DOX在臨床治療中的使用劑量[4]。迄今為止，化學合成藥物或方法不能完全地預防DOX引起的心臟毒性反應[5]。

越來越多的數據顯示，食源性組分已成為抗腫瘤藥物研發中的重要分支[6]。盡管大部分食源性組分的抗腫瘤活性遠遠低于化療藥物，但作為膳食補充，降低腫瘤化療毒副作用的聯合治療模式是腫瘤治療研究的重要方向。在這些食源性組分中，白藜蘆醇的心肌保護作用較為顯著[7]。早在1940年，科研人員就已從毛葉藜蘆根部分離得到白藜蘆醇[8]，但此后卻未能得到人們足夠的重視，直到“法國悖論”現象的出現，才逐漸引起了關注。所謂的“法國悖論”與法國人飲用葡萄酒，攝入大量白藜蘆醇有直接關系。因此，白藜蘆醇在相關的心肌保護研究中倍受青睞，被證實對心血管系統具有較好防護作用。近年來發現白藜蘆醇對DOX造成的心肌損傷有一定的保護作用[7]。鑒于此，本文對DOX誘導的心肌損傷及白藜蘆醇的心肌保護作用進行綜述，旨在為進一步研究白藜蘆醇抗DOX心肌毒性及尋找相關新天然產物提供參考并拓展研究思路。

1 多柔比星的毒副作用

DOX雖然在對抗癌癥方面起到了重要的作用，但是其對機體正常組織造成的嚴重損傷也是眾所周知的，其對心臟、肝臟、腎臟以及睪丸等造成損傷：1）心臟毒性是DOX的主要毒副作用，長期使用甚至可導致致死性心肌損傷，極大程度地限制其在臨床上的應用[9]。DOX誘導的心臟毒性表現涉及多種不同的作用機制，例如氧化應激、鈣超載和細胞凋亡等。2）肝臟毒性是DOX的另一重要毒副作用。作為人體最大的代謝器官，肝臟在新陳代謝中起著至關重要的作用，而DOX也很容易損壞肝臟[10]。據報道，40%接受DOX治療的患者承受著藥物引起的肝臟損傷帶來的痛苦[11]。3）DOX在嚙齒動物模型中表現出腎毒性，導致大鼠腎臟受損，包括腎小球毛細血管通透性增加和腎小球萎縮[12]。4）DOX的骨髓毒性為骨髓抑制，主要表現為白細胞、血小板減少，甚至大部分患者會出現罕見的貧血。此外，DOX對大鼠腸黏膜屏障有損害作用[13]。5）其他：DOX的細胞毒性反應之一為藥物溢出血管外而引起的組織潰瘍及壞死，引起皮炎、色素沉積，此外，大多數患者還出現脫發[14]。DOX可引起食欲減退，并對胰腺組織產生氧化應激、纖維化和細胞死亡等有害影響[15]。

2 DOX介導的心臟毒性

DOX在體內代謝時產生了一種稱為7-deoxyaglycone的代謝產物（圖1A），這種代謝產物對脂類有高度的親和力[16]。由于心肌細胞線粒體內膜含有相對較多的心肌磷脂，因此，DOX進入心臟后易在心肌細胞線粒體中蓄積，導致心臟毒性。DOX引起的急性心臟毒性主要出現在用藥早期，具體表現為心律失常、心功能紊亂、心肌肥大、早期心臟纖維化，這可能是導致左心室功能受損的重要機制[17]；長期用藥可能導致不可逆的慢性中毒，DOX進入機體后，除了作用于腫瘤細胞，心臟作為其毒副作用的靶向器官易受到攻擊，造成鐵紊亂、炎癥反應、細胞自噬和鈣超載。此外，DOX蓄積于心肌細胞的線粒體中，然后在電子傳遞鏈上產生過量的活性氧自由基，這些活性氧自由基使線粒體出現氧化損傷，這些表現可形成促凋亡信號誘導細胞發生凋亡，從而產生嚴重的心臟毒性，臨床上表現為各種心律不齊、心室功能損傷（圖1B）[18]。DOX的心臟毒性已經嚴重地限制了其在臨床上的應用，所以尋找降低DOX心臟毒性的方法很有必要。

圖 1 DOX及其代謝產物7-deoxyaglycone的結構與其介導的心臟毒性Fig. 1 Structures of DOX and its metabolite 7-deoxyaglycone and mechanism of cardiotoxicity caused by DOX

3 白藜蘆醇對DOX心臟毒性的保護作用

白藜蘆醇化學名為3,4,5-三羥基二苯乙烯，分子式為C14H12O3，是一種羥基二苯乙烯類化合物，屬于單寧質多酚[19]。它在植物界分布較廣，存在于花生、葡萄、虎杖和桑葚等多種植物中。自然界中的白藜蘆醇有順式、反式白藜蘆醇和順式、反式白藜蘆醇苷4 種存在形式。而植物中白藜蘆醇主要以反式構象存在，且反式白藜蘆醇苷的含量要遠高于反式白藜蘆醇的含量。白藜蘆醇的純品為無色針狀結晶，熔點256～257 ℃、升華點261 ℃，難溶于水，對光不穩定，易溶于丙酮、乙醚等有機溶劑。白藜蘆醇具有廣泛的生理藥理學作用，其中主要包括抗炎、抗腫瘤、抗氧化應激損傷、保護心腦血管、抑制血小板聚集、調節血脂以及防止動脈粥樣硬化等[20]。由于其具有這些顯著的特點，因而在最近幾年，白藜蘆醇在相關的活性功能研究中備受關注。目前研究較為成熟的是白藜蘆醇的心血管系統保護作用，其對DOX造成的心肌損傷有一定的保護作用。有報道稱白藜蘆醇與DOX聯合使用可預防DOX誘導的心臟毒性，并可在體內和體外對腫瘤細胞產生協同作用，可逆轉DOX長期服用產生的耐藥性[21]。白藜蘆醇在對抗多藥耐藥方面也顯示出良好的作用，在輔助治療中與5-氟嘧啶等聯合使用，白藜蘆醇具有增加癌細胞化學敏感性的附加或協同作用[22]。白藜蘆醇可降低多藥耐藥風險，輔助藥物療效，被認為是一種多靶點、應用前景廣的抗癌藥物，在癌癥預防和治療中都有重要作用[23]。研究已證實，聯合應用白藜蘆醇和DOX是提高DOX療效的有效策略，可促進DOX在細胞內的積累，降低腫瘤細胞的多藥耐藥性，并可改善DOX心臟毒性[24]。

4 白藜蘆醇的抗DOX心臟毒性的作用機制

由于DOX的靶向心肌毒性作用，目前有關DOX毒副作用中，心肌損傷的研究最為廣泛。然而，盡管多年來研究方法已大幅改善，但仍不清楚DOX引起的心臟毒性的具體機制。現階段普遍認為，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和脂質過氧化引起的氧化應激增加、鈣超載、線粒體損傷和細胞凋亡等在DOX心臟毒性產生中起著重要作用。當前主要的機制或假說有氧化應激、鈣失調、線粒體損傷、細胞凋亡等[25-26]，這些因素之間相互聯系、互為因果，形成惡性循環，共同加速心臟毒性的發展。白藜蘆抗DOX的心臟毒性機制復雜，涉及多種信號通路，主要包括抑制自由基生成、鈣超載、線粒體功能障礙、凋亡和自噬等。白藜蘆醇對DOX心臟毒性的抑制涉及多種機制，以下簡要作出幾點歸納。

4.1 白藜蘆醇抑制DOX介導的心肌氧化應激

關于DOX心臟毒性作用的機制，Chen Yumin等[27]認為，當細胞抗氧化系統的自由基清除作用與ROS生成之間處于失衡狀態時，就會產生氧化應激。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶在氧化信號轉導和DOX誘發的心肌病的進展中起重要作用[28]。DOX進入心肌細胞后，DOX中醌結構部分被還原為半醌，半醌自由基轉換為C環。經過一系列電子傳遞過程生成超氧陰離子自由基（O2-·）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（·OH）等（圖2）。此外，研究證明蒽環類藥物對鐵的親和力非常高，蒽環類藥物能與鐵生成蒽環類-鐵復合物，這個復合物還原氧產生ROS，隨后導致游離自由基的生成[23]。這些自由基可以引起線粒體、微粒體脂質過氧化，對多種細胞產生強烈的損傷作用（氧化應激）[29]。氧化應激使細胞膜的結構發生改變，降低膜的流動性，增加通透性，從而影響細胞膜的生物調節功能及離子轉運功能，導致心臟內多種亞細胞變化，包括心肌細胞支架結構完整性的喪失，同時其還能降低抵抗自由基毒性水平的抗氧化劑濃度，造成心肌細胞損傷[26]。白藜蘆醇通過減少ROS生成、增加Mn-SOD和沉默信息調節因子1（silence information regulator 1，SIRT1）活性以及線粒體膜電位的極化來改善線粒體功能[8]；同時，白藜蘆醇可以抑制NADPH和5’-二磷酸腺苷-Fe3+-依賴的脂質過氧化；最后白藜蘆醇顯著上調核因子E2相關因子2靶基因NADPH的轉錄：醌氧化還原酶1、谷氨酰胺半胱氨酸合成酶、血紅素氧合酶-1，可減輕細胞氧化應激[30]；此外，白藜蘆醇（20 mg/kgmb）連續作用大鼠6 周，大鼠心肌脂質過氧化作用降低，且增加了心臟的抗氧化性，為白藜蘆醇對DOX氧化應激的保護作用提供了新的證據[31]。

圖 2 DOX在電子傳遞鏈上的代謝過程Fig. 2 Metabolic process of DOX in the electron transport chain

4.2 白藜蘆醇抑制DOX介導的心肌鈣超載

正常情況下，胞內Ca2+濃度顯著低于胞外Ca2+濃度，胞內Ca2+主要儲存于內質網和線粒體。心肌損傷伴隨著Ca2+從細胞內細胞器的釋放或跨細胞膜的進入導致Ca2+超負荷[32-33]。內質網中有兩種類型的Ca2+釋放通道：Ryanodine受體（ryanodine receptors，RYRs）和三磷酸肌醇受體（inositol 1,4,5-trisphosphate receptors，InsP3Rs）通道，Ca2+可以通過激活RYRs或InsP3Rs來進一步促進Ca2+的釋放，這一過程稱為Ca2+誘導的Ca2+釋放[34]。因此，細胞質的Ca2+超載可能觸發Ca2+的釋放，最終誘導內質網應激和凋亡。同時DOX還能刺激線粒體將Ca2+釋放至胞漿，加重鈣超載[35]。Catanzaro等[36]報道，白藜蘆醇通過穩定內質網，保護H9c2細胞免受氧化還原酶誘導的內質網應激，并顯著促進SIRT1的激活，從而導致心臟細胞存活。白藜蘆醇被證實能夠通過上調SIRT1介導的去乙酰化來抑制氧化還原誘導的心臟毒性，從而改善心肌細胞的鈣循環[37]。鈣穩態的紊亂是一種參與氧化還原作用的機制。DOX的主要代謝物通過改變肌漿網的固鈣能力來改變肌漿網干擾肌漿網Ca2+-ATPase（sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）2功能，刺激肌漿網釋放鈣[38]。DOX引起的S100A1的下調，進而降低了大鼠SERCA2a的表達[39]，相比之下，白藜蘆醇處理后S100A1的上調顯著提高SERCA2a活性，這可能是心臟狀況改善的原因，白藜蘆醇主要通過SIRT1轉錄途徑影響SERCA2a表達，SIRT1是通過調節SERCA2a啟動子活性參與心臟收縮力，S100A1增強Ca2+瞬態，通過抑制舒張期Ca2+超載，減少肌漿網 Ca2+滲漏，從而調節心臟功能[34]。

4.3 白藜蘆醇抑制DOX介導的心肌線粒體損傷

線粒體存在于除紅細胞外的所有細胞中，維持著細胞內鈣和氧化還原反應的平衡，線粒體是受蒽環類藥物影響最大的細胞器[40]，原因之一就是蒽環類藥物與線粒體內膜的心磷脂幾乎不可逆地形成一種復合物。而電子傳遞鏈的蛋白質正常工作時需要結合磷脂，但由于蒽環類藥物破壞磷脂蛋白，因此會抑制呼吸鏈，導致線粒體代謝功能的下降[18]。線粒體是產生ROS的關鍵場所，使線粒體極易受到ROS的攻擊，導致線粒體內外膜發生脂質過氧化損傷[41]。此外，DOX可誘導線粒體DNA損傷[42]和線粒體Ca2+紊亂[43]等，H9c2細胞模型實驗表明，白藜蘆醇可以通過抑制細胞損傷、穩定線粒體、激活SIRT1通路來預防DOX誘導的心臟毒性[44]。白藜蘆醇可增強大鼠心肌抗氧化性，防止氧化應激反應[45]。因此，白藜蘆醇在抑制DOX介導的心肌線粒體損傷、維持線粒體穩定性方面起著重要的作用[46]。

4.4 白藜蘆醇抑制DOX介導的心肌細胞凋亡

體外心肌細胞5 μmol/L DOX和實驗動物在20 mg/kgmbDOX作用下，可導致心肌細胞的大量凋亡。DOX引起的細胞調亡與Bcl-2、Bax蛋白的表達上調和p53上調凋亡調控因子α的表達下調有關，并激活Caspases-9和Caspases-3和多腺苷二磷酸核糖聚合酶[47]。DOX誘導小鼠心臟衰竭并激活了MEK1/2-ERK1/2級聯反應，增加了心肌細胞H9c2細胞的ERK1/2磷酸化[48]。在正常細胞中p53蛋白含量較低，當DNA損傷時，p53在氨基和羧基末端結構域的多個殘基上被幾種不同的蛋白激酶磷酸化，導致p53在細胞質中積累和p53的反式激活，p53依賴的細胞凋亡涉及許多靶基因，包括絲裂原活化蛋白激酶家族和Bcl-2家族蛋白。Bcl-2家族由促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bid和Bad）和抗凋亡蛋白（Bcl-2和Bcl-xL）組成，p53的表達量增加與Bcl-2的下調和Bax的上調相關。凋亡信號級聯導致Bcl-2和Bax的比例明顯降低，p53可與Bcl-xL蛋白結合，引起p53和Bcl-2蛋白的構象改變，導致細胞凋亡[34]。SIRT1表達的下調與氧化還原酶誘導的心肌細胞凋亡有關，研究表明，在DOX處理后，SIRT1的表達降低，同時觀察到白藜蘆醇預處理增加了SIRT1的表達，顯著減弱了DOX誘導的凋亡[49]。此外，5 μmol/L DOX作用H9c2細胞24 h建立DOX毒性模型，DOX可上調H9c2細胞中p53和Bax的表達，下調Bcl-2的表達，白藜蘆醇增加細胞活力，還可以通過增加腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化和減少p53表達來保護大鼠H9c2心肌細胞免受DOX誘導的細胞凋亡，降低凋亡率[50]。因此，白藜蘆醇可抑制DOX介導的心肌細胞凋亡。

4.5 白藜蘆醇調控DOX介導的心肌自噬失調

自噬被認為是一個吞噬自身細胞質蛋白或細胞器的過程，該過程是細胞質成分（例如老化的蛋白質和細胞器）的回收和降解。最近的研究表明自噬細胞死亡可能在DOX誘導的心肌功能障礙中起重要作用。研究表明，DOX處理后顯著抑制了心肌細胞核中自噬小泡的形成，且自噬相關蛋白LC3-II/LC-I的比例增加，表明DOX處理H9c2細胞自噬水平受損[4]。此外，DOX誘導的自噬與線粒體損害密切相關。總地來說，線粒體可以被認為是細胞凋亡、壞死和自噬過程的連接點。心肌自噬被認為是一把“雙刃劍”，根據損傷類型和持續時間以及自噬活性的水平，自噬能在不利環境中提高腫瘤細胞對應激的耐受能力，維持其生存；自噬又能在腫瘤發展的不同階段抑制其產生和轉移，甚至成為某些凋亡缺陷腫瘤細胞的死亡途徑[51]。白藜蘆醇對自噬的調控具有雙向性，已被證明既可以促進自噬[52]，也可在某些特定情況下抑制自噬[53]。當DOX觸發心肌細胞自噬時，白藜蘆醇通過抑制自噬來減弱心臟毒性，這可能是白藜蘆醇通過抑制核糖體蛋白S6激酶1的表達來抑制自噬[54]。當DOX降低心肌細胞自噬時，白藜蘆醇可恢復受損的自噬功能，增加自噬[55]。此外，白藜蘆醇還能減輕糖尿病小鼠心肌細胞凋亡和氧化應激損傷，通過SIRT1/Foxo1/Rab7軸恢復受損的自噬通量[56]。因此，白藜蘆醇可能恢復DOX誘導的心肌細胞自噬的失調。

4.6 白藜蘆醇抑制DOX介導的心肌炎癥反應

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）是先天免疫應答的關鍵組成部分，是炎癥反應的重要早期信號，DOX誘導后巨噬細胞浸潤明顯增強，單核細胞趨化因子1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）和細胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1）的表達增加[52]。促炎細胞因子白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和環氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX2）表達增加，而抗炎性細胞因子白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）表達受到DOX的抑制。炎性小體核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）可調節巨噬細胞IL-10的產生，并有助于緩解DOX誘導的心臟毒性的病理生理過程，對抗NLRP3介導IL-1β相關的炎癥反應。炎癥因子IL-1β受體激活與核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）通路的激活呈正相關，NF-κB信號通路誘導產生的促炎因子、趨化因子、黏附因子以及產生次級炎癥介質的酶COX2、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和誘生型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）。研究表明，促炎介質NO和iNOS水平增加，NF-κB p65表達增加，繼而產生的炎癥反應參與DOX介導的心臟毒性[53]。研究報道，白藜蘆醇可通過降低心肌TNF-α水平，下調TLR-4和iNOS蛋白表達，從而發揮抗炎作用。對NF-κB炎癥通路研究發現，白藜蘆醇可促進NF-κB脫乙酰作用，抑制NF-κB炎癥通路，減少炎性細胞因子IL-6、iNOS和TNF-α的產生[56]。此外，白藜蘆醇是一種有效的化學增敏劑，可通過NF-κB和信號傳導及轉錄激活蛋白途徑發揮作用[57]。

4.7 白藜蘆醇抑制DOX介導的心肌纖維化

DOX心臟毒性的作用機制復雜，具體關鍵性靶向作用機制尚不明確，但DOX介導的心肌損傷最終后果是導致心肌細胞凋亡和壞死，繼而心肌細胞被纖維組織取代，形成心肌纖維化[58]。研究表明，經20 mg/kgmbDOX處理后，大鼠左室心肌出現大量心肌碎裂和肌原纖維溶解，白藜蘆醇可改善DOX誘導的心肌纖維化，DOX不僅上調了轉化生長因子1β基因的表達，還增加了纖維化標志物的含量，誘導了大量膠原纖維在左室組織沉積，而DOX與白藜蘆醇的結合改善了纖維化效應[57]。同時，白藜蘆醇對醋酸去氧皮質酮處理大鼠的心血管重構也有抗纖維化作用。白藜蘆醇和DOX的組合顯著減弱了DOX誘導的心臟毒性，并上調了血管內皮生長因子B（vascular endothelial growth factor B，VEGF-B），白藜蘆醇減弱了siRNA對VEGF-B的抑制作用，從而對DOX處理的心肌細胞起保護作用，表明白藜蘆醇通過上調VEGF-B減輕了DOX誘導的心臟毒性[8]。

5 結 語

天然產物尤其是食源性活性成分，已成為當代社會營養保健和健康管理的選擇趨勢，有著巨大的發展潛力和空間。我國食材資源豐富，有著悠久的養生歷史，在心肌保護功能性食品的研發方面有一定的優勢和獨特之處。DOX劑量依賴性的心肌毒性，其作用機制多樣，天然產物活性成分白藜蘆醇可通過抗氧化應激、調節心肌細胞鈣超載、抑制細胞自噬及凋亡、減輕線粒體損傷等多靶點效應，防治和減輕DOX引起的心臟毒性反應。因此天然產物有效成分白藜蘆醇與DOX聯用，可為抗腫瘤藥物心肌毒性作用的營養干預與治療提供新的參考，二者聯合應用可作為一種新策略降低化療藥物帶來的毒副作用，改善患者腫瘤治療的預后，提高生活質量。然而目前，白藜蘆醇的心肌保護作用機理尚不明確，如白藜蘆醇對S100A1蛋白的調控機制仍需要進一步的研究。此外，未來的動物實驗，可通過白藜蘆醇在惡性腫瘤動物模型中作用及其與其他化療藥物比較研究，探尋白藜蘆醇營養干預與臨床應用的可能。最后，關于白藜蘆醇對DOX誘導的心肌保護作用大多在動物實驗階段，其在臨床上研究尚淺。因此將白藜蘆醇開發成為有效的手段，用以保護成千上萬的癌癥患者在接受化療時對抗非靶向引起的心臟毒副作用，并挖掘其潛在效用，值得進一步研究。