熒光PCR 熔解曲線法在結核分枝桿菌耐藥基因檢測中的應用

李媛媛 蘇東棟

結核病是嚴重危害人類健康的全球十大致死原因之一,尤其是耐藥結核病的出現使結核病治療困難重重,結核病防治任重道遠。所以,高效精準的藥物敏感性試驗(藥敏試驗)和耐藥監測對結核病的檢測和控制十分重要［1］。BACTECMGIT960液體藥敏試驗(MGIT960藥敏試驗)是目前檢測MTB 對一線抗結核藥品耐藥性的常用方法之一［2］。但由于MTB 生長緩慢,此方法耗時較長,約需14 d 才能報告結果,以致患者延誤診斷而錯過最佳治療時機。近年來,隨著檢測技術的不斷進步,各種各樣的分子診斷技術運用于結核病的診斷和耐藥性檢測中,為患者提供更加快速、準確的診斷和治療建議［3,4］。熒光PCR 探針熔解曲線法(熔解曲線法)是目前臨床應用較為廣泛的一種分子檢測技術,其通過對某些耐藥基因在熔解分析中的熔點變化的檢測來判定相應基因是否發生突變［5,6］。本研究設想應用熒光定量PCR 探針熔解曲線法檢測耐多藥結核病患者的臨床分離菌株對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥基因突變,并分析在MTB 耐藥基因檢測中使用熒光PCR 熔解曲線法的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年4 月～2020 年11 月間于本院住院復治肺結核的患者為研究對象,納入符合2017 年版結核病診斷規范中復治肺結核診斷的患者(①因結核病不合理或不規律用抗結核藥物治療≥1 個月的患者；初治失敗和復發患者。②年齡≥17 歲。)作為本次研究的研究對象。獲得培養陽性菌株165 株,經MPB64 快速抗原檢測初篩,160 株為MTB,5 株為非MTB,最終納入160 例(株)為本研究對象。

1.2 方法

1.2.1 標本留取 所有參加本次研究的患者全部完成心電圖、凝血功能、肝腎功能等常規檢查,并禁食8 h,結束后,清晨給予2%利多卡因局部吸入麻醉后經電子支氣管鏡行病灶部位深部痰刷檢,收集患者痰標本,標本量均≥2 ml/份,刷檢痰標本分離培養按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》進行。

1.2.2 MTB 培養及藥敏方法 采用傳統培養法和比例法藥敏試驗,MTB 分離培養,并常規行藥敏試驗。

1.2.3 熒光PCR 熔解曲線法 嚴格按照MTB 利福平、異煙肼、氟喹諾酮類、卷曲霉素、阿米卡星耐藥突變試劑盒說明書操作。DNA 提取：取1.5 ml 處理后的支氣管刷檢樣本(處理同分離培養)加入1.5 ml 離心管。以12000 r/min 離心10 min,棄上清,加入200 μl滅菌水,渦旋振蕩重懸沉淀物,將沉淀重懸液加入核酸自動純化試劑管中,在每份標本中加入40 ml 二硫蘇糖醇(DTT)。將試管放入核酸自動提取儀中,選取結核提取步驟,運行儀器50 min 后,將純化的核酸轉入1.5 ml離心管中,99℃加熱20 min 后14000 r/min 離心10 min,吸取5 μl 上清液,加入到含20 μl PCR 反應液的反應管中,放入ABI7500 實時熒光PCR 擴增儀進行擴增和熔解分析。PCR 反應的程序為將尿嘧啶糖苷酶(UNG)去污染處理2 min,50℃,1 次；預變性95℃,10 min,1 個循環；Touchdown 循環95℃、10 s,71℃、15 s(每個循環下降1℃),78℃、15 s,10 個循環；PCR 循環程序95℃、10 s,61℃、15 s,78℃、15 s,45 個循環。熔解分析：95℃、2 min,40℃、2 min,45～85℃(設置在此階段每1℃采集FAM 和TET 通道熒光信號),1 個循環。

1.3 觀察指標 每例患者采用同一標本進行絕對濃度法和熔解曲線法耐藥基因檢測,對絕對濃度法和熔解曲線法檢測利福平、異煙肼耐藥性結果不一致的對象以絕對濃度法為驗證金標準。觀察熔解曲線法對利福平、異煙肼的檢測敏感度、特異度、準確度。

1.4 統計學方法 采用SPSS24.0 統計學軟件處理數據。計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗；選擇Kappa一致性檢驗檢驗兩種方法。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

同一標本應用兩種方法檢測時,絕對濃度法檢出利福平21 例耐藥,139 例敏感；檢出異煙肼68 例耐藥,92 例敏感。熔解曲線法檢出利福平17 例耐藥,139 例敏感,4 例未檢出結果；檢出異煙肼61 例耐藥,99 例敏感。熔解曲線法對利福平的檢測準確度為96.15%、敏感度為87.50%、特異度為98.39%；對異煙腓的檢測準確度為95.00%、敏感度為88.57%、特異度為96.80%。兩種檢驗方法對利福平及異煙肼的耐藥及敏感率比較,差異均無統計學意義(χ2=0.370、0.636,P=0.543、0.425＞0.05)。

表1 觀察熔解曲線法檢測的準確度、敏感度及特異度(n,%)

3 討論

熒光PCR 熔解曲線法結合了聚合酶鏈反應和熒光探針熔解曲線分析的優點,通過對目的基因進行擴增,觀察其熔解溫度與對照的差值,從而判斷是否有耐藥基因突變［7-10］。該方法簡便、快速、高效,可以準確檢出耐藥基因的具體突變位點,適用于專科醫院進行大批量樣本檢測。

本研究以絕對濃度法藥敏試驗為標準,分別檢測了利福平、異煙肼耐藥情況,結果顯示熔解曲線法對利福平的檢測準確度為96.15%、敏感度為87.50%、特異度為98.39%；對異煙腓的檢測準確度為95.00%、敏感度為88.57%、特異度為96.80%。兩種檢驗方法對利福平及異煙肼的耐藥及敏感率比較,差異均無統計學意義(P＞0.05)。表明熔解曲線法和絕對濃度法的一致性良好。研究中,熔解曲線法檢出對利福平139 例敏感,17 例耐藥,4 例標本未檢出,原因可能RRDR 區域以外的DNA 發生突變或其他機制導致。耐藥熒光PCR熔解曲線法作為快速篩查MTB耐藥的分子學方法,雖然與標準的方法相比不完全一致,且檢測的基因位點有限,但因其良好的敏感度和特異度,節約時間、安全高效,是臨床檢驗及診治耐藥結核的有效手段。

熒光PCR 熔解曲線法作為快速篩查MTB 耐藥的分子學方法,雖然與標準的方法相比不完全一致,且檢測的基因位點有限,但因其良好的敏感度和特異度,節約時間、安全高效,是臨床檢驗及診治耐藥結核的有效手段。