番茄紅素對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠抗糖尿病作用及機制

張丹 潘思影 張會峰 尚進

(1鄭州澍青醫(yī)學高等專科學校，河南 鄭州 450064；2河南省人民醫(yī)院內分泌科；3鄭州大學第一附屬醫(yī)院腎臟內科)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的慢性代謝性疾病之一〔1,2〕。機體長期的慢性高血糖耐受會誘導機制脂質和蛋白代謝紊亂，進而誘發(fā)多種腎臟、心血管等多組織并發(fā)癥，進而對人體健康、壽命、生活質量等構成嚴重威脅。近來有研究表明，糖尿病是一種自身免疫性和慢性炎癥性疾病；長期的高血糖會引起血管內皮細胞損傷，進而誘發(fā)機體產生氧化應激、炎癥等多種病理性變化〔3～5〕。因此，糖尿病相關的炎癥和氧化應激相關研究已經成為糖尿病治療的一個新靶點。雖然西藥在血糖控制方面具有顯著療效；但是長期使用化學藥物不僅會使得患者產生耐藥性，還會造成惡心、厭食、肝腎功能損傷等多種毒副作用，且價格昂貴。然而，中藥在糖尿病的治療過程中具有悠久歷史，能夠顯著改善糖尿病患者機體狀況，并能夠顯著改善患者的并發(fā)癥和毒副作用〔6～9〕。因此，中藥在糖尿病的治療中具有非常廣闊的前景。例如，文獻表明芒果苷和苦瓜果汁等能夠顯著改善鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠體重降低、血糖和自由基升高，并能夠顯著改善機體血脂，具有抗炎、增強免疫等多種藥理活性〔10～11〕。番茄紅素是從茄科植物提取出來的一種非常重要的類胡蘿卜素，其具有抗糖尿病作用，但是作用機制仍不清楚。因此，本研究通過番茄紅素處理糖尿病大鼠8 w后，檢查糖尿病大鼠體重及血糖等指標的變化，并測定機體氧化應激及炎癥因子相關指標，探究番茄紅素抗糖尿病的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體重為(220±20)g，均由河南省動物實驗中心提供〔SYXK(豫)2017-0006〕。實驗大鼠均飼養(yǎng)恒溫(25℃)、恒濕(50%±5%)環(huán)境下統(tǒng)一飼養(yǎng)〔SYXK(豫)2017-0021〕，并且保證動物飼養(yǎng)間通風、干燥，晝夜12 h循環(huán)。本實驗方案設計及操作均經過河南省人民醫(yī)院倫理委員會審批，倫理審查編號：LACUC-20170106025。本實驗操作遵循3R原則。

1.2主要試劑與儀器 番茄紅素和STZ均購買自美國Sigma 公司(美國)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β和IL-6試劑盒均購買自北京索萊寶科技有限公司(北京，中國)；核因子(NF)-κB p-65、p-核因子-κB抑制劑激酶(IKK)β、核因子(IKK)β、p-IκBα和IκBα一抗、熒光二抗購買自大連 Takara 公司(大連，中國)。聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購買自南京建成生物科技公司(南京，中國)。

低溫離心機(Allegra X-30R，Beckman，美國)；CX41熒光顯微鏡(德國Olympus公司)；RM22335型石蠟切片機(德國Leica公司)；酶標儀(iMark，Bio-Rad，美國)。

1.3實驗方法

1.3.1動物模型的制備 實驗大鼠適應1 w后，開始給予高脂、高糖飲食連續(xù)8 w后，腹腔注射給予STZ〔60 mg/(kg·d)〕連續(xù)2 d，以制備糖尿病大鼠模型〔12〕。并分別在72 h和3 d后測定試驗大鼠的空腹血糖，當實驗大鼠空腹血糖持續(xù)高于16.7 mmol/L時，表明糖尿病實驗大鼠模型復制成功。

1.3.2實驗分組及給藥 將造模成功的試驗大鼠隨機分為3組(n=15)：模型組、番茄紅素低劑量組(15 mg/kg)和番茄紅素高劑量組(30 mg/kg)。另取15只健康大鼠作為正常組。分組后，正常組試驗大鼠和模型組試驗大鼠通過灌胃給予相應的生理鹽水，而給藥組則通過灌胃給予相應劑量的番茄紅素，連續(xù)給予8 w。

1.3.3血清生化指標的測定 連續(xù)給藥8 w后，測定實驗大鼠的體重和空腹血糖；然后采用水合氯醛將試驗大鼠麻醉后，腹主動脈取血，室溫放置1 h后，在4℃、3 000 r/m條件下離心15 min；取上清，用于測定SOD、GSH-Px、CAT酶活力與MDA含量及血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平變化；在所有生化指標的檢測過程中，所有操作嚴格按照相應試劑盒的說明書進行，以保證實驗結果的可靠性與可重復性。

1.3.4HE染色觀察試驗大鼠腎臟組織形態(tài)變化 每組試驗大鼠取3只，經10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用4%多聚甲醛溶液(PFA)進行灌流，取出腎臟組織，4% PFA固定24 h后，經脫水處理后進行常規(guī)的包埋、切片，厚度約4 μm。進行常規(guī)HE染色后在光學顯微鏡下觀察各組實驗大鼠腎臟組織的病理學變化。

1.3.5Western印跡檢測腎臟組織中相關蛋白的表達 稱取適量腎臟組織，加入組織裂解液，在冰浴上放置2 h，然后在4℃、3 500 r/min條件下離心10 min后取上清；并按照BCA法測定各組織提取液中的蛋白濃度。然后加入緩沖鹽溶液，沸水浴加熱10 min使得蛋白變性；然后進行十二烷基苯磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)以分離目的蛋白，然后將其轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在搖床上采用TBST洗膜5 min×3次，然后采用5%的胎牛血清(BSA)封閉2 h后加入相應的一抗，并保持在避光、4℃的條件下孵育過夜；在采用TBST洗膜5 min×3次。然后，加入熒光二抗在避光、4℃的條件下孵育2 h。在采用TBST洗膜5 min×3次后，使用Image Studio軟件分析目的蛋白的相對灰度值。

1.4統(tǒng)計學方法 使用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1一般狀況及血糖、腎臟指數(shù)的變化 正常組試驗大鼠的精神狀態(tài)良好，飲食、飲水量正常，皮膚毛色有光澤；而模型組大鼠精神萎靡，出現(xiàn)了明顯的“三多一少”的臨床特征，并且毛色干枯、稀疏；當給予番茄紅素后，其精神狀態(tài)、毛色和日常的飲食、飲水量均明顯好轉，逐漸回調。當連續(xù)給予番茄紅素8 w后，與正常組大鼠相比，模型組大鼠的體重顯著降低(P<0.01)，血糖水平和腎臟指數(shù)均顯著升高(P<0.01，P<0.05)；而給藥組大鼠體重、血糖和腎臟指數(shù)均明顯回調(P<0.01，P<0.05)，表明番茄紅素對于糖尿病引起的體重降低、血糖和腎臟指數(shù)升高具有明顯改善作用。見表1。

表1 各組體重、血糖和腎臟指數(shù)的變化

2.2各組腎臟組織的病理學變化 經過HE染色后可以明顯觀察到，正常組腎臟組織未出現(xiàn)異常，可以觀察到完整的腎小球結構。而模型組腎臟組織則呈現(xiàn)出明顯的病理損傷特征，腎小球體積增大、系膜增生，可以觀察到腎小球上皮細胞呈現(xiàn)空泡并呈現(xiàn)淋巴細胞浸潤。當給予番茄紅素后，其病理學特征均得到明顯改善，并呈現(xiàn)劑量依賴性；表明番茄紅素能夠改善糖尿病導致的腎臟組織損傷。見圖1。

圖1 番茄紅素對糖尿病模型大鼠腎臟組織的影響(HE，×200)

2.3各組腎臟組織中氧化應激水平比較 與正常組相比，模型組SOD、CAT和GSH-Px活性均顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)，表明模型組大鼠機體組織處于過氧化應激狀態(tài)；當給予番茄紅素后，腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT酶活性和MDA水平均顯著回調(P<0.05)，表明番茄紅素對STZ誘導的糖尿病模型大鼠氧化應激損傷具有一定的保護作用。見表2。

2.4各組血清炎癥因子水平比較 與正常組相比，模型組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高(P<0.01)，表明實驗大鼠機體處于過炎癥狀態(tài)；當連續(xù)給予番茄紅素8 w后，STZ誘導的糖尿病大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且番茄紅素高劑量組更加趨近正常組，表明番茄紅素對于STZ誘導的糖尿病大鼠血清炎癥因子水平異常升高具有明顯的改善作用。見表3。

表2 番茄紅素對糖尿病大鼠血清中氧化應激相關指標的影響

2.5IKK/IKB/NF-κB信號通路 與正常組相比，模型組腎臟組織NF-κB p65、p-IKKβ/IKKβ和p-IKBα/IKBα蛋白含量顯著增加(P<0.05)，表明糖尿病大鼠機體處于炎癥狀態(tài)，IKK/IKB/NF-κB信號通路被激活；當給予番茄紅素后，給藥組中的NF-κB p65、p-IKKβ/IKKβ和p-IKBα/IKBα蛋白含量均發(fā)生顯著回調，表明番茄紅素對于糖尿病模型大鼠腎臟組織的炎癥反應具有顯著抑制作用；番茄紅素能夠顯著抑制IKK/IKB/NF-κB信號通路活化。見圖2、表4。

表3 番茄紅素對糖尿病大鼠血清中炎癥因子的影響

1～4：正常組、模型組、番茄紅素低劑量組、番茄紅素高劑量組圖2 番茄紅素對糖尿病大鼠腎臟組織IKK/IKB/NF-κB信號通路的影響

表4 番茄紅素對糖尿病大鼠腎臟組織IKK/IKB/NF-κB信號通路的影響

3 討 論

近年來，隨著經濟的飛速發(fā)展，人們的生活生平和飲食結構均發(fā)生了巨大變化，糖尿病發(fā)病率也正在逐年升高，對人們的生命健康和生活質量帶來了巨大危害〔13,14〕。目前研究表明，機體長時間處于高血糖狀態(tài)，會誘發(fā)機體發(fā)生病理性的生理變化，如氧化應激損傷、炎癥反應等〔15,16〕。此外，糖尿病患者通常也伴隨著脂質代謝異常，進而導致機體氧自由基產生過多，誘發(fā)機體處于氧化應激狀態(tài)。糖尿病與自身炎癥和氧化應激損傷具有密切的關系；因此，糖尿病相關的炎癥反應和氧化應激相關研究已經成為當前減緩、治療糖尿病及其并發(fā)癥的新靶點。

番茄紅素是一種廣泛存在于茄科植物中的類胡蘿卜素，大量研究表明其具有抗氧化等生物活性。本研究也已證實，番茄紅素能夠顯著改善糖尿病大鼠體重異常降低和血糖水平、腎臟指數(shù)的異常升高；并能夠顯著抑制糖尿病大鼠機體氧化應激水平。炎癥反應是機體免疫系統(tǒng)的一種防御機制，但是長期的慢性炎癥狀態(tài)則會導致機體發(fā)生病理性損傷；糖尿病是一種慢性的低度炎癥，血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子水平是監(jiān)控和評價機體炎癥狀態(tài)的重要指標〔17,18〕；本研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠顯著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6升高。此外，氧化應激還可激活NF-κB等多個參與炎癥反應的信號通路，并且IL-1β水平過高，也可激活NF-κB等信號通路；進而導致大量的細胞質蛋白復合物活化，產生IκB激酶復合物，加重機體炎癥反應〔19～23〕。本研究發(fā)現(xiàn)，當連續(xù)給予番茄紅素8 w后，其NF-κB p65、p-IKKβ和p-IKBα蛋白含量顯著降低，表明番茄紅素能夠抑制IKK/IKB/NF-κB信號通路。

綜上，番茄紅素能夠顯著改善糖尿病模型大鼠的體重降低、降低血糖水平、改善機體炎癥水平和氧化應激損傷，并能夠顯著改善腎臟組織損傷和細胞凋亡；其作用機制可能是通過抑制IKK/IKB/NF-κB信號通路活化進而發(fā)揮作用的。