嬰幼兒沙眼衣原體肺炎的臨床特征及基因型分布*

江楊華，李艷，代國知，羅麗裴，陳虹亮

(郴州市第一人民醫院a.檢驗醫學中心，b.血管外科，湖南郴州423000)

沙眼衣原體(Chlamydozoatrachomatis，CT)是引起性傳播疾病的常見病原體之一，據報道全球每年約新增1.3億病例[1]。由于該病原體可以通過多種機制逃避宿主的免疫反應[2]，大部分患者呈攜帶感染，表現為無癥狀，感染后常常被忽視，而延誤治療。感染CT的孕婦可以垂直傳染給新生兒，引起沙眼衣原體肺炎。由于大部分孕婦在懷孕期間沒有進行常規篩查和治療，目前這種病原體仍然是引起嬰幼兒下呼吸道感染的重要病原體。本研究擬通過調查分析湖南郴州地區3個月以內的嬰幼兒沙眼衣原體肺炎的發病情況、臨床特征、CT的基因型分布以及不同基因型CT的致病力差異，為臨床對嬰幼兒沙眼衣原體肺炎的診治、預防提供理論依據。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2019年2月1日至2020年1月30日間在郴州市第一人民醫院住院、年齡≤3個月的肺炎患兒719例，兒童來源分布于郴州地區各縣市區。病例納入標準：(1)發病年齡≤90 d；(2)符合嬰幼兒感染性肺炎診斷：具有咳嗽、氣促、發熱、發紺等呼吸道癥狀；肺部聽診可聞及中細濕啰音或痰鳴音；具有雙肺浸潤影，肺門旁及內中帶肺野間質條索影、片絮影、斑片影等影像學改變。排除標準：(1)先天性氣道發育異常、胎糞吸入綜合征、新生兒急性呼吸窘迫綜合征患兒；(2)痰培養為真菌或百日咳的病例；(3)病例資料不全者。重癥肺炎診斷標準[3]：(1)一般情況差；(2)拒食或脫水征；(3)意識障礙；(4)呼吸頻率明顯增快(嬰兒RR>70次/分)；(5)紫紺；(6)呼吸困難(呻吟、鼻翼扇動、三凹征)；(7)多肺葉受累或≥2/3 肺受累；(8)胸腔積液；(9)血氧飽和度≤0.92；(10)肺外并發癥。出現任何一項即診斷重癥肺炎。根據研究對象肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中是否檢出CT，將患兒分為CT感染患兒組94例和非CT感染患兒組625例。記錄入院時嬰兒的臨床、實驗室和影像學表現及出生時的有關情況。

1.2儀器及試劑 NP968C核酸提取儀及配套提取試劑(西安天隆公司)，ABI 7500熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)，ADVIA 2120i全自動血液分析儀、BNⅡ全自動特定蛋白分析儀(德國西門子公司)。沙眼衣原體(CT)核酸熒光定量檢測試劑(湖南圣湘公司)，2×Taq Plus Master Mix(北京康為世紀公司)，引物由Invitrogen公司合成，C反應蛋白(CRP)測定(散射比濁法)試劑(德國西門子公司)。

1.3BALF采集 由臨床醫生采集，即在利多卡因氣道黏膜麻醉下，經鼻部、會厭到達支氣管各段開口，給予37 ℃生理鹽水0.5～1 mL/kg進行支氣管肺泡灌洗，收集BALF于無菌容器中送檢。

1.4血液標本常規檢驗及BALF標本細胞形態分析 用散射比濁法在BNⅡ全自動特定蛋白分析儀上檢測CRP，在ADVIA 2120i全自動血液分析儀上采用細胞化學染色、激光二維技術和流式細胞學相結合的方法進行血細胞計數。BALF標本采用改良版萊特-吉姆薩染色法獲得各分類細胞計數，每個標本在光學顯微鏡下計數200個細胞，報告不同細胞類型在細胞總數中的比例。

1.5CT的初篩 采用實時熒光定量PCR方法，按照試劑盒說明書操作，病原體DNA拷貝數在500 copies/mL以上者定為陽性，每次PCR運行均包括陽性和陰性對照。

1.6CT分型 CT篩查陽性者用巢式PCR擴增編碼CT主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)的ompA基因，參照GenBank中基因序列(accession number:gi1938326)設計引物。第一步PCR的引物為P1(5′-ATGAAAAAACTCTTGAAATC

G-3′)和P2(5′-CTCAACTGTAACTGCGTATTT-3′)，PCR反應體系體積為25 μL，包括2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，150 μg/mL DNA模板2 μL，去離子水8.5 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性60 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。第二步PCR采用第一步PCR的產物3 μL作為模板，引物為P3(5′-TGAACCAAGCCTTATGATCGACGGA-3′)和P4(5′-TCTTCGAYTTTAGGTTTAGATTGA-3′)，所有試劑量加倍，最終體積為50 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。巢式PCR檢測陽性的產物送廣州睿博公司，在ABI 3730XL全自動DNA測序儀上進行Sanger測序，將測序結果在NCBI中進行Blast比對，從而得到CT病原體ompA基因亞型的型別。

1.7統計學分析 用SPSS 19.0軟件進行。正態分布的連續變量用均值±標準差表示，非正態分布以中位數(四分位數)表示，分類變量以例數和百分比表示。正態分布資料兩組間比較采用兩樣本t檢驗，非正態分布資料兩組間比較采用Mann-Whitney檢驗，計量資料比較采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1實時熒光定量PCR結果 719例入組的肺炎患兒中，采用實時熒光定量PCR方法初篩到CT陽性患者94例，陰性625例。陽性樣本擴增曲線為典型的“S”型，并根據標準品進行定量，陽性CT含量為2.14×106(3.54×105,9.14×106)copies/mL，見圖1。

注：1，強陽性CT檢測樣本；2、3、4、5，4個標準品，濃度分別為4×107、4×106、4×105、4×104 copies/mL。

2.2臨床特征分析 CT感染患兒組與非CT感染患兒組比較，前者通過陰道分娩和犯哮喘的比例顯著高于后者(P<0.05)；前者的產婦年齡顯著低于后者(P<0.01)；而產婦分娩時胎齡的大小、患兒年齡、犯呼吸急促病的占比在兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。在實驗室檢查指標中，前者的嗜酸性粒細胞計數明顯高于后者(P<0.05)，而CRP、白細胞計數和中性粒細胞計數在兩組中差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 CT感染患兒組與非CT感染患兒組參數比較

2.3CT感染患兒與非感染患兒BALF中細胞構成 CT感染患兒組BALF中嗜酸性粒細胞的比例明顯高于非CT感染患兒組(P<0.01)，見圖2；而中性粒細胞、淋巴細胞和吞噬細胞的比例，兩者差異無統計學意義。見表2。

注：左圖為CT陽性樣本，箭頭所示為嗜酸性粒細胞；右圖為CT陰性樣本。

表2 CT感染患兒組與非感染組BALF中細胞構成比較

2.4CT基因型分布及其與致病力關系 94例陽性樣本用巢式PCR驗證，92例為陽性，外送測序均有結果。經Blast比對，其中90例分型成功，2例失敗。共檢測到5種不同的CT基因型，分別為基因型D、E、F、G、J，基因型F占比最高，達50.00%；基因型E次之，為35.87%；基因型J占比最低，為2.17%。輕重癥肺炎患者感染的CT基因型差異無統計意義(χ2=2.865，P=0.721)。見表3。

表3 沙眼衣原體的基因型分布及致病力差異[n(%)]

3 討論

兒童沙眼衣原體肺炎多發生于3個月以內的嬰幼兒，是嬰幼兒肺炎常見發病原因之一。沙眼衣原體肺炎在嬰幼兒中發病率的高低與產婦的感染率相關，且存在區域差異。據研究報道，在不到6個月嬰幼兒中，沙眼衣原體肺炎的發病率為7%～30%[4-6]，并且隨著年齡的下降，感染率呈上升趨勢，越貧窮、衛生條件越差的地區感染率越高[7]。本文對本地區3個月內有呼吸道癥狀的719例嬰幼兒檢測發現，94例CT陽性，沙眼衣原體肺炎發病率為13.07%。

本文發現CT感染患兒組中嬰幼兒通過陰道分娩的比例遠高于非CT感染患兒組，說明陰道分娩會增加嬰幼兒感染CT的概率從而引起沙眼衣原體肺炎。2009年Yu等[8]報道重慶市母親陰道分娩時，CT的垂直傳播率高達66.7%，充分證實了陰道分娩的高傳染性，這與本文結果基本一致。本研究發現，CT感染患兒組其產婦平均年齡明顯小于非CT感染患兒組，可能與年輕產婦性行為較活躍、性伴侶不穩定有關，導致CT感染率增高。

本研究還發現，CT感染患兒組外周血中嗜酸性粒細胞計數和BALF中嗜酸性粒細胞占比，均明顯高于非CT感染患兒組。CT為胞內寄生病原體，小兒感染CT后，常常致病緩慢和延后診斷，以致引起哮喘、氣促等呼吸道疾病，引起過敏反應而導致機體內的嗜酸性粒細胞增多。2011年印度Mishra等[9]報道，CT感染的嬰兒中83.3%的患兒有嗜酸性粒細胞增多癥，嗜酸性粒細胞計數的增大與CT感染顯著相關，與本研究結論一致。

CTompA基因編碼的MOMP被認為是引起宿主免疫反應的主要靶點，參與CT向宿主的黏附[10]。MOMP含有4個對稱間隔的可變結構域，此結構域的改變可影響黏附作用，不同的結構域表現為不同的血清型(由ompA基因型決定)，因此推測不同ompA基因型的CT可能會引起致病程度的差異。本研究對本地區引起肺炎的CT的基因亞型進行分析發現：E和F型為主要亞型，F型占比最高；不同基因亞型的CT對所致肺炎的嚴重程度差異無統計學意義。2015年Li等[6]報道，深圳寶安區嬰幼兒感染的CT主要為E型，這與本研究稍有不同，這可能與地區分布差異有關；而同樣證實CT致病的嚴重程度與基因型無關，與本研究一致。

本文選擇的人群代表性稍有欠缺，CT陽性例數偏少，并且巢式PCR方法檢測的靈敏度(模板含量約為1×103copies/mL)相對較低，CT含量低時不能被檢測到，這些因素可能導致結論會有偏差。

綜上所述，沙眼衣原體肺炎在本地區3個月以下嬰幼兒中普遍流行，陰道分娩增加感染率，同時嗜酸性粒細胞增多是CT感染的臨床表現指標；本地區引起嬰幼兒肺炎的CT基因亞型以E和F為主，尚未發現CT基因亞型與嬰幼兒肺炎嚴重程度間的關聯。