紅茶菌中細菌纖維素產生菌的篩選、鑒定及其發酵動力學模型構建

余瞻，趙福權，徐成龍，王珍珍，張澤鑫，沙如意*，毛建衛,2*

1(浙江科技學院 生物與化學工程學院，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江省農業生物資源生化制造協同中心， 浙江 杭州，310023)2(浙江工業職業技術學院，浙江 紹興，312000)

細菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是由微生物合成的天然生物納米高聚物，因其具有高結晶度、高聚合度，強親水持水能力，較高的生物相容性、適應性和良好的生物可降解性[1-2]，黏稠性、凝膠性、穩定性和完全不被人體消化[3]等特點而被廣泛應用于食品工業中，如以椰子水為原料發酵而成的椰果[4],代替肥肉制備低熱量發酵肉腸[5],作為食品添加劑添加進酸奶[6]及冰淇凌中[7]等。同時作為一種膳食纖維，BC是由美國食品藥品監督管理局公認的安全食品添加劑[8]。目前限制BC廣泛應用的主要因素在其產量低、生產成本高等方面。要實現BC的工業化生產，尋找合適的產生菌和產量的提高顯得至關重要。

產BC的菌屬有醋酸桿菌屬、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、固氮菌屬、氣桿菌屬和產堿菌屬等[9-10]，但其中真正能應用于工業化生產的菌種卻很少。趙航等[11]和尹園等[12]分別利用葡糖醋桿菌J2-1和居間駒形氏桿菌進行發酵，通過對發酵培養基中碳源、氮源、乙醇、有機酸及無機鹽的優化，使得細菌纖維素產量得到有效提高，分別達到9.34和15.68 g/L。紅茶菌[13-14]是獲得高產BC菌種的良好來源。它是一種由糖茶水經酵母、醋酸菌以及少量的乳酸菌的共生菌群發酵而成的茶飲料，在中國已有100多年的使用歷史。盡管目前已有一些利用紅茶菌選育優良菌株的研究[15-16]，但BC的產量仍無法滿足工業化生產的需求。因此本研究以紅茶菌發酵液中各菌種為研究對象，經篩選、分離、鑒定，獲得BC產生菌株，并對該菌株發酵過程中的菌體生長、產物生成及底物消耗動力學模型進行構建和研究，分析發酵過程中各指標動態變化，為BC發酵工藝優化及其工業化生產提供一定的技術支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

紅茶菌，由浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室提供；蔗糖、瓊脂、蛋白胨、葡萄糖、NaOH、MgSO4、K2HPO4，國藥集團化學試劑有限公司；乙醇，上海凌峰化學試劑有限公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術有限責任公司；冰醋酸、制霉菌素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 培養基

富集培養基：葡萄糖2 g，酵母浸粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，檸檬酸0.1 g，MgSO40.5 g，制霉菌素500單位/L，水100 mL，pH 6.0。

分離培養基：葡萄糖2 g，酵母浸粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，K2HPO40.1 g，醋酸0.15 mL，瓊脂2 g，水100 mL，pH 5.0。

發酵液體培養基：葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，MgSO41 g，K2HPO40.1 g，無水乙醇3 mL，水100 mL。

發酵固體培養基：葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，MgSO41 g，K2HPO40.1 g，無水乙醇3 mL，瓊脂2 g，水100 mL。

種子培養基：葡萄糖1 g，酵母浸粉1 g，無水乙醇3 mL，水100 mL，pH 6.0。

以上培養基均121 ℃滅菌15 min;無水乙醇均在各培養基滅菌后，無菌條件下進行添加。

1.2 儀器與設備

GZX-9140MBE電熱鼓風干燥箱、YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司；Allegra X-12R冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；EM-1011電子顯微鏡，日本電子公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 產細菌纖維素菌株的篩選

將紅茶菌接于富集培養基中，30 ℃、160 r/min，搖床培養24 h。隨后準確移取100 μL梯度稀釋后的菌液至分離培養基中涂布分離[17]。挑選分離培養基平板上生長較好的單菌落，于發酵液體培養基中30 ℃培養，觀察并挑選出具有菌膜的菌株即為BC生產菌株。將篩選所得菌株按1%的接種量接種于液體發酵培養基中，每組3個平行，30 ℃培養箱中培養4 d，取出BC膜，經過0.1 mol/L的NaOH溶液處理后，烘干稱量挑選產量高且遺傳性狀穩定的菌株，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 菌種鑒定

1.3.2.1 形態及生理生化特征鑒定

將挑選出的菌株分別同時接種于發酵固體培養基和液體培養基中，30 ℃恒溫培養72 h，記錄菌落大小、形狀、顏色、液面是否有菌醭或菌島，底層是否有沉淀等。對菌種進行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察細菌的形態，記錄菌體大小、形狀、繁殖方式等。

根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》[18]和《常見細菌系統鑒定手冊》[19]進行生理生化特征檢測，主要包括：色素實驗、生酮實驗、唯一氮源實驗、產5-酮基葡萄糖酸鹽、運動性實驗、高糖實驗、乙醇生長實驗、產醋酸定性試驗、氧化乙酸實驗以及產BC試驗等。

1.3.2.2 分子生物學鑒定

對挑選出的菌株進行16S rDNA序列檢測(委托生工生物工程(上海)股份有限公司)，將菌株測序的序列提交至美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)Genbank數據庫，采用基本檢索工具進行同源性序列比對相似性分析，并利用分子進化遺傳分析軟件MEGA 8.0構建16S rDNA基因的系統發育樹，采用鄰接(neighbor-joining, NJ)法進行菌株16S rDNA基因分析，以確定菌株種屬。

1.3.3 細菌纖維素的發酵制備

將篩選所得菌株接種至種子培養基中，30 ℃、150 r/min恒溫活化培養24 h。隨后將活化后的種子液以6%接種量接入發酵培養基中，30 ℃恒溫靜置培養14 d獲得BC膜，每隔24 h取樣測量菌體濃度、還原糖含量以及BC產量并記錄。每個菌株做3個平行。

1.3.4 菌體濃度的測定

在培養基(培養14 d)中加入2 mL在0.1 mol/L的醋酸鉀-醋酸緩沖液中活化完全的纖維素酶溶液(100 IU/g)，于50 ℃，pH 5.0的條件下充分水解 2 h。取適量稀釋后水解液在610 nm波長下測量菌體濃度OD610。

1.3.5 還原糖含量的測定

使用DNS法[20]測定發酵液中還原糖含量。

1.3.6 細菌纖維素產量的測定[21]

將BC膜取出水洗后，置于0.1 mol/L的NaOH溶液溶液中，100 ℃水浴30 min以除去殘余的培養基和細菌殘骸，用純水反復洗滌或浸泡直至中性，得到白色透明狀的BC膜。將膜置于烘箱中105 ℃烘干至恒重，稱量記錄。

1.3.7 發酵動力學模型的建立

利用Origin 8.0 軟件對BC發酵過程中菌體生長、產物生成以及底物消耗的實驗數據進行擬合分析，分別建立菌體生長模型、產物生成模型以及底物消耗動力學模型。

1.3.7.1 菌體生長動力學模型

選用Logistic方程模擬菌體生長趨勢，建立菌體生長模型。菌體生長模型的微分表達式如公式(1)所示：

(1)

公式(1)積分可得公式(2)：

(2)

式中：X0為菌體初始生物量，OD值；Xm為菌體最大生物量，OD值；X為t時刻的菌體生物量，OD值；μm為最大比生長速率，h-1；t為發酵時間，d。

將公式(2)積分變形得到公式(3):

(3)

1.3.7.2 產物生成動力學模型

選取Luedeking-Piret方程[30]來描述BC產物的生成模型，如公式(4)所示：

(4)

式中：P為產物濃度，g/L；X為菌體生物量，OD值；t為發酵時間，d；α為與菌體生長有關的合成常數；β為與菌體量有關的合成常數。

將公式(1)、(2)代入公式(4)式并積分得公式(5)：

(5)

(6)

1.3.7.3 底物消耗動力學模型

底物消耗的模型表達式如公式(7)所示：

(7)

式中：S為底物濃度，g/100mL；YX/S為菌體對底物的得率系數；YP/S為產物對底物的得率系數；m為細胞維持系數；t為時間，d。

將公式(4)代入公式(7)可得公式(8)：

(8)

(9)

(10)

分別將公式(1)、(2)代入公式(9)并積分可得

S=S0-k1C(t)-k2D(t)，即如公式(11)所示：

(11)

2 結果與分析

2.1 分離菌株的形態特征觀察

采用涂布分離法分離得到5株BC生產菌株，將它們分別命名為C1、C2、C3、C4、C5，并在相同的條件下進行發酵培養，形態特征和產BC的能力如表1所示。5株菌均為白色圓形菌落，菌落光滑不透明且邊緣整齊，微凸黏稠，無沉淀和菌醭，在培養特征以及細胞形態學特征上并無明顯差別，初步判定為同一菌屬。5株菌發酵4 d后都具有比較良好的BC的產量，其中C1菌株產量最高。進一步對C1菌株進行電鏡觀察，如圖1所示，C1菌體表面光滑，呈近似棒狀，菌體之間有絲狀物連接，符合產纖維類桿菌菌細胞及形態的特征。

表1 分離菌株細菌纖維素產量及形態特征觀察Table 1 Morphological characteristics and the production of bacteria cellulose of the isolated strains

圖1 C1電鏡觀察圖Fig.1 Electron microscope picture of C1

2.2 菌株生理生化特征

從5株菌中挑選BC產量最高的C1進一步進行鑒定實驗。對C1進行生理生化鑒定的實驗結果如表2所示。該菌株產生5-酮基葡萄糖酸鹽；沒有生酮作用；不能氧化利用乙酸；不產生褐色素；能在乙醇中生長；不利用硫酸銨作為唯一氮源，即不屬于氮源自養型微生物；不具有鞭毛，不具有運動性；能產生醋酸；在高糖環境下不能生存；革蘭氏染色呈陰性。將實驗所得結果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》對比，得出該菌株為醋酸菌屬。

表2 菌株生理生化試驗結果Table 2 Physiological and biochemical test results of strains

2.3 分子生物學鑒定

利用ITS1和ITS4、NS1和NS6兩對引物擴增供試菌16S rDNA近5′端的區域，得到約600、1 300 bp片段，供試菌的內轉錄間隔區1和2、16S rDNA電泳結果見圖2。將該菌序列結果在GenBank數據庫進行比對，同源菌株基因用MEGA 8軟件處理，得到系統進化樹如圖3所示，C1與木糖駒形氏桿菌(Komagataeibacterxylinus)在同一分支且具有極高同源相似性。結合菌株C1形態學特征分析，將菌株C1鑒定為木糖駒形氏桿菌。

圖2 供試菌的內轉錄間隔區1和2、16S rDNA凝膠電泳圖Fig.2 The internal transcribed spacers 1 and 2 and 16S rDNA gel electrophoresis of the tested bacteria

圖3 C1菌株系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of C1

2.4 細菌纖維素發酵過程中各參數的變化

糖駒形氏桿菌發酵過程中pH、菌體濃度、BC產量以及還原糖消耗量變化如圖4所示。

圖4 細菌纖維素發酵過程中各參數變化Fig.4 Changes of various parameters during bacteria cellulose fermentation

由圖4可知，木糖駒形氏桿菌的菌體生長總體呈現S型曲線，在1～7 d處于對數生長期，7 d之后趨于平緩進入平穩期。同時隨著菌體濃度上升，BC的產量同樣呈現上升趨勢，還原糖含量和pH值呈下降趨勢；當菌體進入穩定期后，BC生成速率大幅提高，還原糖的消耗速率以及pH值的變化逐漸趨勢平緩。發酵初期菌種生長代謝旺盛，大量產酸，導致pH快速下降；而隨著發酵過程的繼續推進，菌體生長逐漸進入穩定期，菌種少量產酸甚至不產酸，pH也相應的緩慢下降至穩定。發酵第14天產BC達到最高產量4.26 g/L。從實驗結果中可以看出在BC的發酵過程中還原糖的消耗主要被用于菌體的生長，而BC在發酵初期隨著菌體的生長而緩慢合成，其合成速率主要取決于菌體濃度的多少。木糖駒形氏桿菌產BC的發酵過程屬于部分生長偶聯型，這與察可文等[22]認為的BC生成與菌體細胞的生長以及細胞的濃度均有相關性相一致。而邵偉等[23]，齊香君等[24]通過對木醋桿菌發酵產BC過程中各參數進行監測，根據相同時間內BC干重的變化趨勢與菌體生長趨勢相似，推測BC的生成與細胞的生長呈相關關系，BC是細胞代謝的產物，BC的發酵過程屬于生長偶聯型。這主要是由利用的菌種和培養條件差異所致。

2.5 發酵動力學模型構建

2.5.1 菌體生長動力學模型

Monod模型是最早應用于菌體生長的模型，但是該模型把限制性底物的濃度作為影響菌體生長過程中比生長速率的唯一因素，具有較大的局限性。Logistic模型則是一個典型的S型曲線，在符合菌體生長趨勢的同時[25-26]，也能夠較好地反映菌體自身生長而表現出對自己的抑制作用[27]。根據實驗結果顯示，木糖駒形氏桿菌的生長同樣呈現S型，因而選用Logistic模型來描述菌體的生長。

將X0=0.109，Xm=1.618，μm=0.791代入公式(2)得到菌體的生長動力學模型：

菌體的生長動力學模型擬合曲線如圖5所示，相關系數R2=0.998，說明該方程的實驗值與預測值擬合良好，可以以此描述BC生長控制的模型。

圖5 菌體生長動力學模型擬合曲線Fig.5 The fitting curve of kinetic model of bacterial growth

2.5.2 產物生成模型

在分批發酵過程中，產物的生成與菌體生長的關系分為3種：生長偶聯型、非生長偶聯型和部分生長偶聯型[28-29]。根據前述實驗結果所示，BC的產量在菌體對數生長期和穩定期均持續上升，說明BC的合成與細菌的生長及其菌體濃度均具有相關性，屬于部分生長偶聯型。因而選取Luedeking-Piret方程[30]來描述BC的產物生成。

將X0=0.109，Xm=1.618，μm=0.791及β，α代入公式(5)得到BC產物生成的數學模型：

BC生產量的擬合曲線如圖6所示，相關系數R2=0.958 9，結果表明理論值與實驗值擬合良好，該方程能夠較好地描述發酵過程中BC產物的生成情況。

圖6 產物生成模型擬合曲線Fig.6 The fitting curve of product generation model

2.5.3 底物消耗模型

一般認為在發酵過程中，限制性底物的消耗主要分為3個部分：菌體生長、產物合成以及細胞維持正常生命活動的消耗[31]。因而底物消耗模型由產物生成及菌體生長模型結合得出。

隨后以S-S0-k2D(t)～C(t)作圖，擬合后得到：S-S0-k2D(t)=-0.328 2C(t)-0.041 9，由此可得k1=0.328 2。將X0=0.109，Xm=1.618，μm=0.791及k1，k2代入公式(11)，得到葡萄糖底物消耗的數學模型：

-0.222 12×ln(0.932 63+0.067 37e0.791t)

葡萄糖底物消耗的擬合曲線如圖7所示，相關系數R2=0.962 3，說明該方程與實驗測量值擬合較好，能夠以此方程為參考描述發酵過程中葡萄糖底物的消耗情況。

圖7 底物消耗模型擬合曲線Fig.7 The fitting curve of kinetic model of substrate consumption

3 結論

通過對紅茶菌中菌種進行篩選，獲得5株產BC菌株C1、C2、C3、C4、C5，隨后對這5株菌進行形態學觀察，初步判定為同一菌屬，符合產纖維類醋酸菌細胞及形態特征。隨后通過生理生化實驗以及16S rDNA序列分析將BC產量較高的菌株C1鑒定為木糖駒形氏桿菌。

以篩選所得木糖駒形氏桿菌為出發菌株發酵制備BC，監測發酵過程中各指標的變化，分別構建發酵產BC的菌體生長、產物生成以及底物消耗動力學模型。結果表明木糖駒形氏桿菌發酵14 d產BC最高產量為4.26 g/L，產量良好，具有進一步的應用價值，BC的發酵合成屬于部分生長偶聯型。構建的3個模型相關系數R2分別為0.998、0.958 9和0.962 3，說明實驗值與模型擬合良好，能可靠地描述發酵制備BC過程中各參數變化，為BC產量的提升以及進一步工業生產提供技術支持與理論指導。后續研究中可根據發酵動力學模型對BC發酵過程進行精準調控如，建立流加發酵工藝等，以進一步提高細菌菌纖維素的產量。