根際促生菌對沉水植物的促生效應及其與沉積物氮磷賦存形態的關系

王會會 李前正 李亞華 王 川 吳振斌 周巧紅

(1.中國科學院水生生物研究所淡水生態和生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2.中國科學院大學, 北京 100049;3.中國地質大學, 武漢 430074)

沉積物是湖泊生態系統中氮、磷等營養鹽的主要貯存庫, 營養鹽的釋放會對水體產生不利影響,控制營養鹽從而削減內源污染是湖泊水環境保護和治理重點關注的內容[1]。沉水植物作為水體中重要的初級生產者, 對生態系統的物質循環與能量流動起調控作用, 它可以通過根系吸收和自身積累去除沉積物中的營養鹽和重金屬等污染物[2]。利用苦草(Vallisneria natans)去除沉積物氮和磷負荷的研究表明, 苦草生物量達最高時, 沉積物中 NH4-N 和NO3-N的含量可降低一半左右[3], 沉積物間隙水溶解性總磷的含量降低 90%[4]。苦草、黑藻(Hydrilla verticillata)和菹草(Potamogeton crispus)在試驗周期內對沉積物TP的最大降低幅度分別為60.7、35.3和25.9 mg/kg[5]。因此沉水植物的生長和生物量的擴大是促進植物強化內源控制的前提條件, 利用沉水植物進行湖泊沉積物修復和營養鹽控制得到了廣泛關注[6]。然而沉積物又是影響沉水植物生長的主要因素之一, 在沉水植物生長、形態和分布特征等方面起決定作用[7,8]。沉水植被在恢復過程中常受到高負荷沉積物脅迫等問題困擾[9], 沉積物中過高的營養鹽會脅迫沉水植物種子萌發, 幼苗生長, 甚至有毒害作用, 從而影響整個湖泊生態恢復進程。有機質含量較高會導致沉積物成為還原性腐泥, 對水生植物產生脅迫效應, 不利于水生植物的存活和萌發[10]。研究表明, 沉水植物自然恢復通常在水體營養水平降低后的數十年才得以實現[11],因而在生態工程中常用人工輔助的恢復方式。

植物根際促生菌 (Plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR) 是指定植于植物根際, 并能直接或間接地促進植物生長的一類細菌的總稱[12]。目前在水稻和小麥等作物[13]、藥用植物[14]及經濟林木[15]中分離出眾多PGPR菌株。大量研究表明, 根際有益微生物有增強植物耐受干旱脅迫、鹽堿脅迫、重金屬脅迫和養分虧缺等非生物脅迫能力。接種特定PGPR菌株可以緩解作物的鹽脅迫[16,17]。Lasudee等[18]將PGPR菌株Streptomyces thermocarboxydus接種水稻后, 其通過增強溶解磷, 分泌脯氨酸、植物激素和嗜鐵素, 提高了水稻的抗旱能力, 促進了干、鮮重及葉綠素等生理指標的明顯提升。PGPR的接種對于非生物脅迫下沉水植物的恢復是否具有一定作用, 相關研究目前較少。

本研究以高有機質沉積物作為脅迫條件, 進行苦草植物的恢復實驗, 通過接種PGPR的方式探究其對苦草生長及沉積物中氮磷賦存形態變化的影響, 以期為受污染湖泊沉水植物的恢復提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 沉水植物根際促生菌

研究團隊前期以根系分泌物為唯一碳源開展了沉水植物根際促生菌的篩選, 共篩選得到61株PGPR。分別對61株PGPR進行1-氨基環丙烷-1-羧酸(1-aminocy clopropane-1-carb oxylate, ACC)脫氨酶活性、溶P、產吲哚乙酸 (Indole-3-acetic acid,IAA)及產細胞分裂素(Cytokinins, CKs)能力共4個促生指標的測定, 最終比選了8株優良PGPR菌株并進行了16S rDNA的測定。將8株PGPR進行苦草種子萌發試驗, 進一步得到PC2、H19和L3三株最優菌株。接種苦草種子的處理后, 萌發的苦草幼苗株高分別增加了95.7%、69.6%和81.2%。本研究選用PC2、H19和L3三株PGPR進行苦草成株的接種實驗, 菌種來源、鑒定結果及促生性能等具體結果如表1。

1.2 實驗設計

根據前期試驗篩選得到PC2、H19和L3三株PGPR, 共設置CK、PC2、H19和L3四個處理組。根據加拿大環境和能源部發布沉積物中營養鹽的環境質量評價標準, 有機質含量超過17.2%的沉積物為嚴重污染級[19], 本研究采用的高有機質沉積物來自杭州西湖西里湖湖心區域, 該區域無沉水植物生長, 其有機質含量為17.4%。每個處理在30 cm×50 cm×35 cm(長×寬×高)的箱子里均勻擺放15個種植杯(直徑5 cm, 高8 cm), 杯底部鋪設5 cm高度的沉積物, 每個杯內種植大小一致, 生物量相同的5株苦草幼苗。該實驗在室外自然光照下進行培養, 實驗時間為2019年的7—11月, 培養溫度范圍是5—36℃,實驗周期120d, 每隔3d補充一次上覆水(自來水), 使種植水深維持在35 cm, 每隔15d使用一次性滴管向植物根際補充一次菌液(A600=1、2), 空白處理用超純水代替。分別在實驗開始前(0)、20d、40d、60d、90d和120d進行樣品采集, 每次采樣隨機選取每個處理的3個種植杯, 收集植物樣品及沉積物樣品。在實驗周期結束時, 沉積物有機質含量未產生顯著性變化。

1.3 指標檢測方法

植物樣品: 每個處理隨機選取6株苦草植株, 測定其株高、根長、地上鮮重和根鮮重。

沉積物樣品: 樣品在自然風干后, 研缽研磨過100目篩, 置于干燥器儲存備用。總磷(TP)、鐵鋁結合態磷(Fe/Al-P)、鈣磷(Ca-P)、無機磷(Inorg-P)和有機磷(Org-P)均采用SMT化學分級提取法[20], 沉積物各種形態磷含量采用鉬銻抗分光光度法測定;總氮(TN)采用過硫酸鹽消化法[21]、氨態氮(NH4-N)、硝態氮(NO3-N)和亞硝態氮(NO2-N)均采用氯化鉀溶液浸提-分光光度法[22]。測定前繪制標準曲線, 并根據標準曲線計算各形態氮、磷的含量。

1.4 統計分析

數據統計分析與繪圖分別采用SPSS19.0與Origin8.0。以單因素方差分析(One way ANOVA)多樣本間的顯著性檢驗, Duncan法進行多重比較。選用皮爾森相關(Pearson)進行數據間的相關性分析, 規定顯著水平P＜0.05。采用Canoco4.5軟件包進行物種間的主成分分析(Principal component analysis,PCA)及物種與環境因子間的冗余分析(Redundancy analysis, RDA)。

2 結果

2.1 PGPR對苦草的促生效應

PGPR對苦草的生長變化影響在實驗結束后, 4個處理組苦草的生長情況如圖1所示, 接種處理組苦草植株的形態特征均優于空白處理。對各處理組不同時期苦草的株高、根長、地上鮮重及根鮮重進行單因素方差分析, 具體分析結果如圖2所示。結果表明, 空白對照中苦草的株高顯著低于PGPR處理組。高有機質試驗進行20d, 接種PGPR的3個處理組株高較空白處理均有顯著性差異(圖2a), 在整個試驗過程中, 3個接種PGPR的處理組株高均顯著高于空白處理組。在實驗結束時,PC2處理組株高比空白處理增加了165.0%。40d時,接種PGPR的3個處理組的根長(圖2b)、地上鮮重(圖2c)和根鮮重(圖2d)均與空白處理有顯著性差異。空白處理組的根長一直呈上升趨勢, 其各時間段的平均值均低于其他3個處理組。在實驗結束時,PC2處理組根長、地上鮮重和根鮮重比空白處理分別增加了17.4%、378.8%和 165.1%。PC2處理組優于H19和L3處理組, 在實驗結束時, PC2處理組的株高較H19和L3處理組分別增加了9.0%和40.0%;H19和L3處理組根長相同, PC2處理組的根長較H19和L3增加了10.2%; PC2處理組的地上鮮重較H19和L3處理組分別增加了11.4%和65.7%; PC2處理組的根鮮重較H19和L3處理組分別增加了37.5%和53.9%。由此可見, 沉積物高有機質顯著抑制苦草的生長, 接種PGPR對苦草生物量的擴大具有顯著作用, 進而能夠加快逆境下植物的恢復進程。

表1 三株PGPR(PC2、H19、L3)基本信息情況表Tab.1 Basic information of the three strains of PGPR (PC2, H19, L3)

苦草生長指標的主成分分析(PCA)根據生長指標的顯著性分析基本可以判斷PGPR的接種有利于苦草在高有機質沉積物中的恢復, 為了綜合判斷不同菌株處理之間的影響差異, 本研究進一步結合各個生長時期的結果, 采用主成分分析(PCA)評價多變量樣本間差別[23]。對苦草不同生長時期(0、20d、40d、60d、90d和120d)的株高、根長、地上鮮重及根鮮重數據進行PCA計算分析, 以確定不同處理對苦草生長影響的差異性。第一軸和第二軸總共解釋了總變異的98.4% (圖3), 且第一軸解釋度占絕對優勢, 表明4個指標在苦草不同生長時期的結果均呈現較好的一致性。3個接種處理組與空白處理明顯分開, 尤其是PC2處理組距離空白處理距離最遠、H19次之、L3最近, 表明PGPR接種對苦草生長促進的綜合影響為PC2＞H19＞L3。

2.2 PGPR對沉積物氮磷賦存形態的影響

沉積物磷賦存形態及變化沉積物TP的初始含量為1442.9 mg/kg (圖4a), Org-P和Inorg-P的含量分別為459.1和983.8 mg/kg (圖4b和4c), Inorg-P含量是Org-P的2.1倍, Fe/Al-P為初始沉積物中主要的Inorg-P(圖4e)。在接種處理后, TP含量下降,實驗進行90d時, L3處理組TP達到最低, 減少了25.9%。Ca-P在整個實驗周期內相對穩定, 其含量為249.9—461.0 mg/kg, 僅PC2接種組在90d出現顯著的上升(圖4d)。Fe/Al-P含量呈現一定的波動, 隨實驗的進行呈V形波動。

圖1 實驗結束時(120d)四個處理組苦草植株生長情況Fig.1 Plant growth of V.natans in four treatment groups on the 120th day

沉積物氮賦存形態及變化沉積物TN的初始含量為5423.8 mg/kg (圖5a), Org-N和Inorg-N的含量分別為5376.9和35.9 mg/kg (圖5b和5c), 其中Org-N占TN的比例超過95.0%。在整個實驗周期內, 接菌處理組TN和Org-N的含量與空白處理組無顯著性差異。在3種形式的Inorg-N中, 以NH4-N為主導, 其次是NO3-N和NO2-N。NH4-N和NO3-N都呈現先下降再略微上升的趨勢(圖5d和5e), 實驗結束時PC2的NH4-N和NO3-N比CK分別下降了34.8%和25.7%。NO2-N含量占無機氮的比例最小, 后期顯著積累(圖5f), PC2和H19的接種顯著抑制了NO2-N的上升, 其含量比CK分別低27.4%和32.9%。

圖2 PGPR接種對苦草的生長變化影響及其顯著性分析Fig.2 Effects of PGPR inoculation on the growth of V.natans and their significance analysis

圖3 基于植物生長指標的PCA分析Fig.3 PCA analysis based on plant growth index

圖4 沉積物中不同磷賦存形態Fig.4 Different phosphorus forms in the sediment samples

圖5 沉積物中不同氮賦存形態Fig.5 Different nitrogen forms in the sediment samples

2.3 PGPR接種與沉積物氮磷賦存形態的關系探討

通過植物生長指標與沉積物氮磷賦存形態現存量的分析, 初步得到PC2菌株接種對沉積物氮磷賦存形態尤其是無機形態具有顯著的影響。為進一步探討PGPR接種與植物生長、沉積物氮磷賦存形態的相關關系, 選用苦草各生長指標及不同氮磷賦存形態含量在每個測量周期內的變化量(即后一采樣時間與前一采樣時間的差值)來進行指標增加量的分析。首先對數據進行DCA分析(Detrended correspondence analysis, 去趨勢對應分析)以獲得第一軸的梯度長, 本研究第一軸的梯度長小于3, 所以選用RDA分析。RDA分析結果表明(圖6), ΔTN、ΔNH4-N、ΔNO3-N、ΔNO2-N、ΔInorg-N、ΔOrg-N、ΔTP、ΔCa-P、ΔFe/Al-P、ΔOrg-P和ΔInorg-P共11個環境因子增量共解釋了83.6%的生長指標變化。Δ株高與ΔNO3-N、ΔNO2-N、ΔInorg-N和ΔInorg-P等負相關; Δ根長與ΔNO3-N、ΔInorg-N、ΔFe/Al-P和ΔInorg-P等負相關; Δ地上鮮重與ΔFe/Al-P、ΔInorg-N、ΔInorg-P、ΔNH4-N和ΔNO3-N等負相關; Δ根鮮重ΔFe/Al-P、ΔInorg-N、ΔInorg-P和ΔNO3-N等負相關。在此基礎上, 進行各生長指標增量與環境因子增量的Pearson相關分析(表2),結果表明, Δ株高與ΔNO3-N和ΔNO2-N極顯著負相關, 與 ΔInorg-N和ΔInorg-P顯著負相關; Δ根長ΔNO3-N、ΔInorg-N和ΔInorg-P顯著負相關; Δ地上鮮重與ΔFe/Al-P極顯著負相關; Δ根鮮重與ΔFe/Al-P和ΔInorg-P顯著負相關。相關分析結果在RDA分析中均有呈現, 因此ΔInorg-N、ΔNO2-N、ΔNO3-N、ΔInorg-P和ΔFe/Al-P是與苦草各生長指標增量顯著相關的重要環境因子。

3 討論

3.1 PGPR促進植物生長恢復的效果與作用原理

圖6 生長指標增量與沉積物各氮磷形態增量的RDA分析Fig.6 RDA analysis of the increment between plant growth index and sediment N and P forms

表2 生長指標增量與環境因子增量的相關性分析Tab.2 Correlation analysis between growth index increment and environmental factor increment

本研究旨在探討PGPR對苦草的促生效應及與沉積物氮磷賦存形態相互關系, 以期得到加快受污染湖泊沉水植物恢復及削減內源污染的方法。結果表明, 在高有機質負荷的沉積物條件下, PGPR的接種可以有效抵抗植物生長所受的脅迫, 顯著提高植物生物量的積累, 尤其是地上部分株高和生物量的積累。實驗進行第20天時, PC2、H19和L3處理組株高較空白均有顯著提高, 第40天時, PC2、H19和L3處理組根長、地上鮮重及根鮮重與空白均有顯著性差異, 較空白均有大幅度提高。在試驗結束時, 空白處理種植的苦草生長受到抑制, 株高降低了32.2%, 盡管根長略有增加, 但地上和地下鮮重沒有顯著變化。進一步表明高有機質沉積物對苦草的抑制地上部分呈“扁平化”, 地下部分呈“細長型”。在接種的3株PGPR中, PC2對苦草的生長促進作用最為顯著。PC2篩選自菹草根際, 但溶磷能力、產IAA及CKs能力高于H19和L3, PGPR的促生能力不受宿主沉水植物的影響, 菹草為耐污型沉水植物, 因此PC2有更強的促生能力; H19的溶磷能力、產IAA及CKs能力低于L3, 但ACC脫氨酶活性約為L3的6倍, ACC脫氨酶可以將合成乙烯的前體ACC分解為氨和 α -丁酮酸來減少乙烯合成, 從而降低植物對逆境的敏感性, 提高植物抗逆能力。因此, 對苦草生長促進的綜合影響H19＞L3可能與ACC脫氨酶活性有關。趙偉進等[24]在PGPR對黑青稞幼苗的促生試驗中發現, 各接菌處理組對黑青稞幼苗的須根數、莖粗等有一定促進作用, 不接菌的空白處理, 黑青稞幼苗的根長、莖粗及須根數等受到抑制。此外, 王歡等[15]發現4株PGPR菌株對白菜、空心菜、莧菜和水稻的株高均有促進作用, 其中GD12和GD3菌株效果最優。GD12菌株處理后白菜株高比空白增加59.5%, 水稻株高比空白增加15.8%; GD3菌株處理后空心菜株高比空白增加38.2%, 莧菜株高比空白增加37.5%。

PGPR是一類存在于根際周圍, 能夠通過自身特有功能, 如溶磷解鉀、產IAA和固氮作用等直接或間接促進植物生長的微生物。研究表明, PGPR可以利用色氨酸合成植物激素吲哚乙酸(IAA),能夠顯著促進甜菜、芥菜、小麥等植物的生長[25];產ACC脫氨酶細菌接種小麥, 可顯著降低干旱脅迫對小麥生長的負面影響等[26]。PGPR通過與植物發生相互作用, 能夠改良土壤, 活化土壤礦物質,提高植物養分吸收, 減少病害, 提高產量等[27]。目前, PGPR與植物的互利共生關系在農業領域已有長期的應用和發展, 其次是在林業、草地業, 針對營養獲取、抵抗環境脅迫、病原防治和遷地移栽等問題, 其應用的核心目的是農業的可持續性與植被保護[28—30]。面對水生態系統退化、沉水植物難以自然恢復、水體生物與非生物環境因素的多重脅迫等問題時, 本研究的初步結果表明, PGPR與沉水植物的互利共生關系可以成為一個有潛力的恢復方法。

3.2 PGPR對沉積物無機氮磷污染修復的潛力

為進一步探討PGPR接種后沉水植物生長與沉積物氮磷賦存形態的相關關系, 選用苦草各生長指標及不同氮磷賦存形態含量在每個時期的變化量進行冗余分析和皮爾森指數相關分析。分析結果表明, 苦草各生長指標增量與沉積物中ΔInorg-N、ΔNO2-N、ΔNO3-N、ΔInorg-P和ΔFe/Al-P等顯著負相關, PGPR對沉積物中Inorg-N、NO2-N、NO3-N、Inorg-P和Fe/Al-P等無機態氮磷的削減有促進作用, 以PC2菌株的作用效果最為明顯。農田土壤為氮、磷、鉀等養分的貯存庫, PGPR菌肥可對土壤養分庫進行活化, 促進植物對營養元素的吸收。如解磷微生物的解磷機制通常認為是微生物能分泌有機酸, 既能夠降低pH, 又可與鐵、鋁、鈣和鎂等離子結合, 從而使難溶性磷酸鹽溶解; 解鉀微生物是土壤中分離出來的一種能分化鋁硅酸鹽和磷灰石類礦物的細菌, 能夠分解鉀長石, 磷灰石等不溶的硅鋁酸鹽的無機礦物, 還能促進難溶性的鉀、磷和鎂等養分元素轉化成為可溶性養分, 增加土壤中速效養分含量以促進作物生長發育, 提高產量[31]。PGPR菌肥的施用使得土壤微生物種群密度增大,根際微生態環境得到改善, 從而提高了土壤速效氮、磷等的含量[27]。在本研究中, 苦草Δ地上鮮重與ΔFe/Al-P呈極顯著負相關, 表明對沉積物Fe/Al-P的控制和削減需要重點考慮沉水植物地上生物量的擴大。今后可以從PGPR的優化篩選和接種、對泥水界面氮磷通量的影響等方面進行深入探究, 使具有綠色、高效特點的PGPR在水生態系統恢復的過程中發揮積極的作用。

4 結論

本研究將沉水植物根際篩選到的PC2、H19和L3三株芽孢桿菌屬PGPR接種到苦草植株根際, 結果表明在高有機質沉積物條件下, PGPR接種后苦草生長狀況顯著優于非接種組; 120d時, 空白處理種植的苦草生長受到抑制, PC2處理組株高比空白處增加了165.0%, 根長比空白處理增加了17.4%, 地上鮮重比空白處理增加了378.8%, 根鮮重比空白處理增加了165.1%。進一步分析PGPR與沉積物氮磷賦存形態的相互關系, 通過RDA分析與皮爾森指數相關分析得出PGPR對沉積物中Inorg-N、NO2-N、NO3-N、Inorg-P和Fe/Al-P等無機態氮磷的削減有促進作用。研究結果拓展了PGPR在水體生態系統中的應用, 為人工輔助恢復沉水植物及削減內源污染提供思路。