三疣梭子蟹Pt-ddit4l基因的克隆及表達分析

閻德平 呂建建, 陸 璇 張 文 題興斌 宋 柳 劉 萍,

(1.中國水產科學研究院黃海水產研究所, 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室, 青島 266071;2.青島海洋科學與技術國家實驗室, 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室, 青島 266071)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一種重要的海洋經濟動物, 因其肉味鮮美, 蛋白含量高, 已成為我國沿海地區的主要養殖蟹類, 在黃渤海及東海區域養殖尤為廣泛[1,2]。隨著養殖規模的不斷擴大, 病害爆發愈加頻繁, 給梭子蟹養殖業造成了巨大的經濟損失。而副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是造成三疣梭子蟹批量死亡的主要致病菌之一[3]。本實驗在前期開展的弧菌脅迫全基因組重測序中成功檢測并鑒定到一個跟副溶血弧菌性狀相關的SNP標記(P=0.013, 數據未發表), 并成功定位于ditt4l(DNA damage inducible transcript 4 like)基因上, 推測該基因可能是一個具有副溶血弧菌抗性的基因。

DDIT4L又被稱為REDD2/RTP801L, 該基因具有參與DNA損傷修復和介導細胞凋亡的功能, 是DDIT家族中重要的一員[4,5]。該基因首先發現于人的白血病細胞系中, 在相關處理下, 可以使細胞行使吞噬功能, 隨后形成參與免疫反應的巨噬細胞[6]。ddit4l基因在哺乳動物的C端相當保守, 含有一個RTP_901C蛋白結構域。此外ddit4l基因還具有調節胚胎發育、參與無氧代謝及介導細胞凋亡的功能[7—9]。但目前尚未有該基因在甲殼動物免疫防御方面的報道。

為了探究三疣梭子蟹Pt-ddit4l基因的結構特征和功能, 克隆了三疣梭子蟹Pt-ddit4l的cDNA全長,并對不同發育階段、組織分布、弧菌感染和RNA干擾下的表達情況進行了深入的研究, 為豐富DDIT基因家族的功能提供了參考, 也為進一步研究三疣梭子蟹在弧菌感染下的免疫防御機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實驗所使用的三疣梭子蟹均來自中國水產科學研究院黃海水產研究所下營實驗基地。2018年8月實驗所用梭子蟹均為體重(40±3) g的80日齡個體, 先放置于若干個大整理箱(660 mm×400 mm×310 mm)中暫養1周, 暫養期間持續供氧, 溫度保持在23℃, 鹽度8.0, pH 8.3, 每晚6點及時更換自然海水和投喂新鮮餌料。

2019年4月在下營實驗基地育苗期間, 根據薛俊增等[10]關于三疣梭子幼體發育不同時期的鑒定方法, 在三疣梭子蟹苗種繁育期間采集其幼體發育各期的樣品(取3組平行樣品), 包括囊胚期、原腸期、眼點期、心跳期、溞狀幼體Ⅰ期(Z1)、溞狀幼體Ⅱ期(Z2)、溞狀幼體Ⅲ期(Z3)、溞狀幼體Ⅳ期(Z4)和大眼幼體期(M), 樣品放置于液氮中保存[10]。

1.2 病原感染實驗

從暫養1周后健康的80日齡梭子蟹中隨機取9只, 分別取其肝胰腺、心臟、血細胞、眼柄、鰓、胃、腸和腦等組織樣品, 來自3只梭子蟹的同組織樣品混合成一管, 置于液氮中保存。隨后進行副溶血弧菌感染實驗, 參照張杰等[2]實驗方法加以改進。將暫養1周后健康的梭子蟹隨機分成PBS對照組和副溶血弧菌感染組, 每組50只, 并設置3個平行, 隨后分別于三疣梭子蟹游泳足第一關節基膜處注射100 μL的PBS(濃度為10 mm/L)和副溶血弧菌(濃度為3.8×106cfu/mL)。在注射后的0、3h、6h、12h、24h、48h和72h收集梭子蟹的血細胞和肝胰腺組織樣品, 每組隨機取3只。其血細胞的收集方法參照宋柳等[11]進行, 每只于游泳足第一關節基膜處抽取1 mL血液與抗凝劑緩沖液(檸檬酸鈉1.32%,檸檬酸0.48%和葡萄糖1.47%)混合, 隨后移置到1.5 mL無RNA酶的離心管中, 在4℃下4000 r/min離心10min,隨后將上清液丟棄將血細胞保存下來, 樣品標記編號后統一放置于液氮中保存。

1.3 三疣梭子蟹Pt-ddit4l基因cDNA全長的克隆

根據本實驗室全基因組重測序數據庫中得到的Pt-ddit4l基因部分序列, 使用引物設計軟件Primer Premier 6.0 設計中間片段擴增引物, 以及5′和3′所需要的基因特異性引物, 引物參見表1, 由北京睿博興科生物科技有限公司進行合成。

利用引物REDD2F/ REDD2R進行基因中間片段擴增, PCR反應擴增體系為20 μL, 包括: 13.6 μLddH2O, 2.5 μL 10× TransTaq?HiFi Buffer I, 1.6 μL 2.5 mol/L dNTPs, 0.4 μL TransTaq?HiFi DNA Polymerase, 0.4 μL Forward/Reverse primer (10 μmol/L)and 1 μL template DNA。反應程序如下所示: 94℃,5min; 94℃30s, 60℃30s, 72℃, 1min, 35個循環;72℃, 10min; 4℃, 恒溫保存。將擴增得到的PCR產物送交青島擎科梓熙生物技術有限公司進行測序,然后和獲得的unigene片段進行比對, 確保保守區域的正確性。

表1 實驗所用引物名稱及序列Tab.1 Primers used in this study

使用SMARTTMRACE試劑盒對Pt-ddit4l基因3′和5′進行擴增, 先進行第一輪PCR擴增, 使用引物REDD2F1/REDD2R1和UPM進行擴增; 隨后將PCR產物稀釋10倍作為下一輪擴增的模板, 使用引物REDD2F2/REDD2R2和NUP混合進行第二輪PCR擴增, 反應體系和程序如上所述。制備1%的瓊脂糖凝膠進行PCR產物電泳, 將正確的電泳條帶經DNA切膠回收、pMD18-T載體連接、轉化入DH5α感受態細胞中, 最后挑選單一菌落并使用通用引物M13F/M13R(表1)進行陽性克隆鑒定, 篩選目的菌液完成測序。

1.4 生物信息學分析

使用Vecror NTI 11.0軟件去除多余的載體序列, 然后將序列正確拼接, 拼接好的目的片段使用國家生物技術信息中心NCBI-BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對分析。使用Bioedit和Gene Tool進行開放閱讀框(ORF)的預測,并對編碼的氨基酸進行翻譯。氨基酸序列通過Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/search)進行蛋白質功能結構域預測分析; 蛋白質分子質量、不穩定性指數、親水系數、理論等電點和信號肽通過Ex-PASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)預測。使用分子進化遺傳型分析軟件MEGA 6.0以Neighbor-Joining 法構建系統進化樹, 對Ptddit4l基因的親緣關系進行進一步的分析。

1.5 Pt-ddit4l基因在發育不同時期的表達分析

使用RNAiso Plus試劑根據說明書步驟分別提取三疣梭子蟹不同發育時期總RNA。從提取的三疣梭子蟹發育不同時期總RNA中選取高質量的樣品通過Reverse Transcriptase M-MLV (RnaseH)試劑盒反轉錄合成cDNA, 合成的cDNA模板用于后續實時熒光定量PCR。利用Primer Premier 6.0軟件設計用于Pt-ddit4l幼體發育不同時期表達分析的熒光定量引物Pt-REDD1qF/Pt-REDD1qR, 內參基因使用β-actinF/β-actinR(表1)。以三疣梭子蟹發育不同時期的cDNA為模板, 進行實時熒光定量RT-PCR擴增。反應總體系為10 μL, 包括5 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix, 1 μL Template cDNA, 0.4 μL Primer F(10 μmol/L), 0.4 μL Primer R(10 μmol/L), ddH2O補足至10 μL。每個樣品設置3個平行重復和內參對照, 反應程序設置如下: 95℃10min; 95℃ 5s, 60℃ 34s, 總共35個循環。

1.6 Pt-ddit4l基因mRNA表達分析

按照上述1.5的方法分別提取三疣梭子蟹9個組織和病原脅迫后各時間點樣品的總RNA, 反轉錄合成cDNA。以稀釋后的cDNA為模板, 進行實時熒光定量PCR。擴增體系和反應程序同上述發育不同時期。實時熒光定量PCR實驗結果數據采用相對標準曲線法2-ΔΔCt法進行相對表達定量計算, 計算出平均表達量和標準差, 使用SPSS 19.0軟件對計算結果進行單因素方差分析,P＜0.05表示差異顯著, 并通過OriginPro 2018將統計的結果整理成柱狀圖。

1.7 RNA干擾實驗

Pt-ddit4l基因的雙鏈RNA(dsRNA)的合成方法參照Kim等[12]的體外轉錄的方法合成, 設計的引物序列見表1。將暫養1周后健康的三疣梭子蟹隨機分為PBS陰性對照組和RNAi取樣組, 每組各40只。按照Bai等[13]的實驗方法進行注射, 對照組和實驗組分別在梭子蟹游泳足第一關節基膜處注射50 μL的dsRNA(1 μg/g)和PBS(10 mm/L), 在注射后的12h后每組隨機取3只梭子蟹收集血細胞和肝胰腺,提取RNA, 利用qPCR檢測dsRNA注射后REDD基因沉默的效率。并在注射后的第12h, 對照組和實驗組再注射50 μL副溶血弧菌(濃度為3.8×106cfu/mL),在弧菌感染后的3h、6h、12h和24h統計每組梭子蟹的死亡率。該實驗同時設置3個平行。

2 結果

2.1 Pt-ddit4l基因序列分析

Pt-ddit4l基因cDNA全長2727 bp, 包括698 bp的5′-UTR, 1522 bp的3′-UTR和507 bp的開放閱讀框(ORF), ORF編碼168個氨基酸(圖1), 預測分子質量為19.14 kD, 理論等電點為5.41, 不穩定系數為54.05, 親水系數為-0.177, 歸類為不穩定親水蛋白。通過預測還發現該基因在13—15氨基酸處有一個糖基化位點, 在46—160氨基酸位置處含有一個RTP801_C結構域, 且該結構域在物種間相當保守。

利用MEGA 6.0軟件對Pt-ddit4l編碼的氨基酸序列與其他同源物種的氨基酸序列構建進化樹分析, 結果如圖1所示, 本研究中的Pt-ddit4l先與凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)聚為一支, 再與大型蚤(Daphnia magna)相聚, 它們的親緣關系最近, 形成一個獨立的分支, 接著與棘皮動物的紫色海膽(Strongylocentrotus purpuratus)、日本刺參(Apostichopus japonicas)和馬蹄蟹(Limulus polyphemus)聚為一支, 而與同屬梭子蟹科的濱蟹(Green Shore Crab)相距較遠。

圖1 構建的DDIT4L的系統進化樹Fig.1 The phylogenetic tree based on the sequences of different DDIT4L family members

2.2 Pt-ddit4l在不同組織中的表達分布

利用qPCR技術對Pt-ddit4l在三疣梭子蟹各組織中的表達量進行檢測, 結果發現Pt-ddit4l在三疣梭子蟹的各組織中均有表達, 在肝胰腺中表達量最高, 約為心臟中表達量的2.8倍; 其次在鰓中表達量最高, 為心臟中表達量的1.1倍 (圖2)。

2.3 Pt-ddit4l基因在不同發育時期的表達分布

如圖3所示, 胚胎發育時期,Pt-ddit4l的表達量逐漸上升, 在心跳期時表達量達到最高, 且與囊胚期中的表達量差異顯著(P＜0.05); 而在溞狀幼體發育時期,Pt-ddit4l的表達量出現明顯下調, 隨后出現回升, 在溞狀幼體Ⅳ期和囊胚期相比無顯著差異(P＞0.05); 隨后大眼期的表達量也明顯下調, 顯著低于囊胚期(P＜0.05)。

圖2 三疣梭子蟹ddit4l基因在健康組織中mRNA相對表達量Fig.2 The relative ddit4l mRNA level in healthy tissues of ddit4l P.trituberculatus

圖3 三疣梭子蟹不同發育階段ddit4l基因的相對表達量Fig.3 Relative expression of ddit4l at different larval development stages of larval P.trituberculatus

2.4 Pt-ddit4l在副溶血弧菌感染后的表達分析

ddit4l如圖4所示, 在血細胞中, 注射副溶血弧菌后,Pt-ddit4l基因的表達量呈先上升后下降的趨勢, 12h時達到峰值, 是對照組表達量的8.85倍(P＜0.05), 除24h出現下調之外, 整體呈上調趨勢。而在肝胰腺中, 注射副溶血弧菌感染后,Pt-ddit4l表達量出現顯著下調, 72h達到最低值, 僅為對照組表達量的1/40 (P＜0.05)。

2.5 注射dsRNA后Pt-ddit4l基因的表達分析及弧菌感染下死亡率統計

圖4 三疣梭子蟹血細胞和肝胰腺感染副溶血弧菌后Pt-ddit4l的表達情況Fig.4 The relative expression of Pt-ddit4l in hemocytes and hepatopancreas of P.trituberculatus infected with V.parahaemolyticus

圖5 RNA干擾后Pt-ddit4l 在三疣梭子蟹血細胞和肝胰腺中的表達情況Fig.5 The relative expression of Pt-ddit4l in hemocytes and hepatopancreas of P.trituberculatus injected with RNAi

如圖5所示, 在肝胰腺中, RNA干擾組6—24h的基因表達量顯著下調, 與對照組相比分別下降了17%、88.8%和36%; 在血細胞中, RNA干擾組6—24h的基因表達量顯著下調, 與對照組相比分別下降了61.7%、49.4%和81.1%。注射RNAi后12h再注射副溶血弧菌感染的死亡統計結果如圖6所示, 發現注射RNA干擾的實驗組相比起對照組死亡率明顯增高, 這些結果表明Pt-ddit4l參與了三疣梭子蟹弧菌感染后的免疫防御機制。

圖6 RNA干擾下感染副溶血弧菌的梭子蟹死亡率統計Fig.6 Mortality of swimming crab infected with V.parahaemolyticus by RNA interference

3 討論

3.1 Pt-ditt4l的序列特征

為進一步探究副溶血弧菌感染下三疣梭子蟹的免疫防御機制, 本實驗通過分子標記成功定位到一個具有副溶血弧菌抗性的基因, 通過基因克隆首次獲得三疣梭子蟹Pt-ddit4l序列全長, 將其命名為Pt-ddit4l, cDNA全長為2727 bp, 編碼一個由168個氨基酸組成的多肽。BLAST相似性比對和系統發育樹進化分析發現其與甲殼動物中的凡納濱對蝦相似性最高為60%, 在進化樹上單獨聚為一分支,隨后與其他物種的ddit4l基因聚為一類。由此確定該基因為三疣梭子蟹DDIT4家族新的成員。

3.2 Pt-ditt4l基因的表達分布

在本研究中,Pt-ddit4l在各組織中均有表達, 其在肝胰腺的表達量最高, 而肝胰腺是三疣梭子蟹的重要免疫器官, 暗示其可能發揮重要的免疫功能[14,15]。通過分析三疣梭子蟹在不同發育階段的表達量發現,Pt-ddit4l基因在發育的不同階段均有一定的表達, 但在胚胎發育期間表達量出現明顯上調; 而溞狀幼體期間表達量與囊胚期相比沒有顯著上調(P＞0.05), 推測Pt-ddit4l基因可能主要在三疣梭子蟹的胚胎期發揮作用, 這與對小鼠胚胎染色發現發育早期的信號較強的結果相似[16]。這些結果都表明Pt-ddit4l基因可能發揮了一定的維持正常發育或抵御外界病原感染的功能。

3.3 Pt-ditt4l基因的免疫防御機制

受到弧菌感染后,Pt-ddit4l在肝胰腺中的表達量出現明顯下調, 且顯著低于對照組(P＜0.05)。而Imen等[15]通過對人單核細胞U-937進行瞬時轉染的研究結果也表明在ddit4l基因表達水平高的細胞中,Bax/Bcl2 mRNA的比率顯著增加, 與正常細胞相比Bax的表達量幾乎不變或略微下降, 而Bcl2基因的表達量卻顯著下降, 推測其可能介導了細胞凋亡,且在一定程度上抑制了凋亡基因發揮作用; 在受到弧菌感染后, 肝胰腺中Pt-ddit4l表達量降低可能促進凋亡基因表達以清除體內病原微生物, 但其具體機制尚不明確, 有待進一步的深入研究[17]。甲殼動物免疫屬于非特異性免疫, 血細胞在機體的抗病免疫反應中發揮著重要的作用[18,19]。外界異物可以刺激血細胞提高其吞噬能力, 如對克氏原螯蝦和扇貝注射病毒和細菌可顯著提高它們血細胞的吞噬活性[20—22]。梭子蟹在受到副溶血弧菌入侵時, 血細胞可能產生吞噬作用將其轉移到細胞內部后滅殺,而本實驗結果也顯示, 弧菌脅迫后Pt-ddit4l的表達量顯著上調, 12h時在血細胞中達到峰值(8.85倍),表明Pt-ddit4l基因可能提高血細胞的吞噬活性。此外,Pt-ddit4l在受到副溶血弧菌刺激后的血細胞中的表達趨勢與Zhang等[23]、Yang等[24]和Wang等[25]報道的C-型凝集素、C型清道夫受體和Toll受體免疫因子受到弧菌刺激后的變化趨勢一致。因此, 我們可以推斷Pt-ddit4l在免疫防御過程中也發揮了一定的作用, 可能為一種新的免疫因子。

為了進一步證明Pt-ddit4l是否參與三疣梭子蟹的免疫防御, 本研究通過RNA干擾對該基因進行了沉默, 隨后進行副溶血弧菌感染實驗, 結果表明: 在注射dsddit4l后,Pt-ddit4l基因表達量出現顯著下調(P＜0.05), 這表明對該基因的干擾是有效的; 同時,沉默Pt-ddit4l基因后, 感染弧菌的實驗組死亡率顯著高于對照組, 且在6h時死亡率差距最大, 這與干擾后基因沉默的時間表現出吻合。這些結果都表明了, 三疣梭子蟹的Pt-ddit4l基因參與了體內的先天免疫應答。

本研究探究了三疣梭子蟹在病原感染下Ptddit4l基因的表達模式及調控機制, 成功克隆了Ptddit4l基因的cDNA全長, 分析了Pt-ddit4l基因在胚胎發育、組織表達分布、弧菌感染以及注射RNA干擾和副溶血弧菌感染后的死亡統計, 初步了解到ddit4l基因的響應機制, 為深入探究三疣梭子蟹在副溶血弧菌感染中的作用機制提供了理論支持。