長牡蠣“海大2號”四倍體的人工誘導

李永國 李 琪, 于瑞海

(1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室, 青島 266003; 2.青島海洋科學與技術(shù)國家實驗室, 海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 青島 266237)

長牡蠣(Crsssostrea gigas)又稱太平洋牡蠣, 是我國北方主要的牡蠣養(yǎng)殖品種, 由于其具有生長速度快、適應能力強以及肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富等特點, 已成為世界上養(yǎng)殖范圍最廣的經(jīng)濟貝類之一。2017年, 我國牡蠣產(chǎn)量487.9×107kg[1], 占全國貝類產(chǎn)量34.0%, 全國海水養(yǎng)殖產(chǎn)量24.4%, 牡蠣養(yǎng)殖在我國海水養(yǎng)殖業(yè)中占有十分重要的地位。

目前, 我國北方養(yǎng)殖的長牡蠣大多為二倍體,上市季節(jié)主要集中在10月至次年3月。二倍體長牡蠣4月以后開始進入性成熟期, 隨配子的發(fā)育體內(nèi)糖原大量消耗, 肉質(zhì)變差; 夏季進入產(chǎn)卵期后, 軟體部變得消瘦, 往往無法供應市場[2]。而長牡蠣三倍體在夏季性腺發(fā)育程度較低, 幾乎不育[3], 可以填補二倍體長牡蠣夏季市場的短缺, 實現(xiàn)高品質(zhì)牡蠣的全年供應, 近年來備受產(chǎn)業(yè)的關(guān)注。此外, 三倍體長牡蠣具有生長速度快[4,5]、肉質(zhì)好[6]及部分抗病能力[7]等優(yōu)點, 因此開展長牡蠣三倍體良種的培育對于促進牡蠣產(chǎn)業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要意義。

長牡蠣三倍體有2個主要的獲得途徑。一是由長牡蠣二倍體通過物理或化學處理誘導三倍體, 但是存在存活率低、成本較高、三倍體率不穩(wěn)定以及難以自群繁育來穩(wěn)定獲得三倍體等問題; 二是先獲得長牡蠣四倍體, 然后和長牡蠣二倍體雜交來獲得100%三倍體[8], 而且四倍體可以通過自群繁育來擴大種群, 為長牡蠣三倍體的商業(yè)化生產(chǎn)提供四倍體親本保障。根據(jù)卵子的來源不同, 獲得長牡蠣四倍體的方法可以分為2種, 一種是抑制長牡蠣二倍體受精卵第一極體釋放誘導牡蠣四倍體[9,10], 另一種是先獲得長牡蠣三倍體, 再利用三倍體牡蠣的卵子和二倍體牡蠣的精子授精, 并抑制其第一極體釋放來誘導四倍體[11]。前者不需要三倍體親本, 且育種周期相對較短。適宜的誘導條件是獲得長牡蠣四倍體的關(guān)鍵, 在使用細胞松弛素B(CB)誘導貝類四倍體的過程中, CB濃度[10]、起始誘導時間[12]和誘導持續(xù)時間[13]是3個影響誘導結(jié)果的重要因素。很多研究往往只研究了其中1個因素對誘導長牡蠣四倍體的影響, 2個或者3個因素及其交互作用對誘導長牡蠣四倍體的影響鮮有報道。

長牡蠣“海大2號”是從長牡蠣野生群體中篩選左殼色為金黃色個體構(gòu)建基礎(chǔ)群體, 以金黃殼色和生長速度作為選育目標性狀, 采用家系選育和群體選育相結(jié)合的混合選育技術(shù)選育而成。其左右殼和外套膜均為色澤亮麗的金黃色, 大大提高其商品價值[14], 而且生長速率顯著高于未經(jīng)選育的長牡蠣,在山東和遼寧等地取得了良好的養(yǎng)殖效果。本研究以長牡蠣“海大2號”二倍體為研究對象, 探討了CB濃度、起始誘導時間及誘導持續(xù)時間對誘導長牡蠣“海大2號”四倍體的影響, 以期篩選出長牡蠣“海大2號”四倍體適宜誘導條件, 為培育長牡蠣“海大2號”四倍體提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗親貝為2齡的長牡蠣“海大2號”二倍體, 殼高(89.37±8.74) mm, 濕重(61.37±12.42) g, 取自山東榮成桑溝灣養(yǎng)殖海區(qū), 并于萊州市長漁水產(chǎn)有限公司進行室內(nèi)人工促熟至性腺成熟。解剖獲取精子和卵子, 授精前檢查卵子熟化程度, 并確認卵子無精子污染。把精卵混合時刻作為受精的零時刻。

1.2 四倍體誘導與幼蟲和稚貝的培育

為探討CB濃度、起始誘導時間及誘導持續(xù)時間對誘導長牡蠣“海大2號”四倍體的影響及篩選適宜的四倍體誘導條件, 分別設(shè)置4個CB濃度梯度(0.3、0.5、0.7和0.9 mg/L)、3個起始誘導時間梯度(10、15和20min)及4個誘導持續(xù)時間梯度(10、15、20和25min), 共48個處理, 每個處理設(shè)置3個重復。實驗使用海水鹽度為32, 處理過程中控制水溫為24℃。在實驗過程中嚴格控制時間, 在誘導處理完成后, 立即用1000目篩絹收集并用砂慮海水充分沖洗, 然后將其轉(zhuǎn)移到含有1 mL/L DMSO(二甲基亞砜)的砂濾海水中, 30min后用篩絹過濾, 并用砂慮海水充分沖洗后轉(zhuǎn)移到實驗桶中孵化。8h后固定幼蟲樣品材料, 用于染色體計數(shù)。24h后統(tǒng)計D形幼蟲率, 并用流式細胞儀檢測幼蟲倍性。其中, D形幼蟲率為所有D形幼蟲占受精卵的百分比。

為檢測誘導方法的有效性, 將3個誘導處理組的幼蟲轉(zhuǎn)移到水泥池進行養(yǎng)成, 日常管理過程同普通二倍體牡蠣幼蟲的培育過程。附著后, 將稚貝轉(zhuǎn)移到山東榮成桑溝灣養(yǎng)成。

1.3 四倍體的倍性鑒定

流式細胞儀分析: 流式細胞儀可以快速判斷早期幼蟲群體的倍性組成以及確定個體的倍性。取受精24h后的幼蟲于離心管中, 加入1 mL 1×PBS(Phosphate buffered saline)緩沖液, 用1.5 mL注射器吸打后, 300目篩絹過濾, 75%乙醇固定, 4℃保存過夜。離心(300×g)后倒掉上清液, 加入1 mL 1×PBS,再加入20 ng/mL RNA酶A反應30min后, 最后再加入35 μL的PI(1 mg/mL)染色30min, 經(jīng)300目篩絹過濾后, 利用流式細胞儀檢測細胞DNA含量。180日齡時, 取幼貝鰓絲再次進行倍性檢測。

染色體計數(shù): 取受精10h后的胚胎, 0.1%秋水仙素溶液處理2h, 0.075 mol/L氯化鉀低滲處理30min, 重復2次。然后使用新配置的卡諾固定液固定3次, -20℃保存。熱滴片后顯微鏡下觀察拍照, 進行染色體計數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用OriginPro 9.1作圖, 利用SPSS 23.0軟件進行方差分析, 差異顯著度為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同時期的倍性檢測

受精10h時, 對照組中, 只有20條染色體的長牡蠣“海大2號”的二倍體細胞。在誘導處理組中, 可以觀察到二倍體(2n=20)、三倍體(3n=30)及四倍體(4n=40)的細胞(圖1), 而且同一個誘導處理組中有三者同時存在的情況, 同時也存在一些非整倍體細胞。染色體計數(shù)結(jié)果表明誘導處理中存在長牡蠣“海大2號”四倍體胚胎。

受精24h時, 對D形幼蟲群體進行倍性檢測, 與對照組只有二倍體幼蟲相比, 誘導處理組幼蟲群體通常由2—3個不同倍性的幼蟲群體組成(圖2), 而且幼蟲群體中不同倍性幼蟲所占比例會隨誘導條件的變化而改變。

受精180d時, 對表1中自上而下3個處理組的幼貝進行倍性檢測, 其檢測數(shù)量分別為73、45和66個。幼貝倍性檢測結(jié)果顯示, 2個誘導處理組中檢測到長牡蠣“海大2號”四倍體幼貝(圖2), 并且與受精24h相比, 四倍體率有顯著的降低(表1)。

2.2 CB濃度、起始誘導時間及誘導持續(xù)時間對長牡蠣“海大2號”D形幼蟲四倍體率的影響

圖1 長牡蠣“海大2號”二倍體(a)、三倍體(b)、四倍體(c)和非整倍體(d)胚胎中期分裂相Fig.1 Example metaphase of diploid (a), triploid (b), tetraploid (c) and aneuploidy (d) embryos of C.gigas “Haida No.2”

圖2 流式細胞儀檢測長牡蠣“海大2號”D形幼蟲及幼貝倍性Fig.2 Ploidy composition of C.gigas “Haida No.2” larvae and spat samples determined by flow cytometry

表1 流式細胞儀檢測長牡蠣“海大2號”180日齡幼貝倍性Tab.1 Flow cytometry analysis of C.gigas “Haida No.2” spats at 180 day

在不同誘導條件下, 長牡蠣“海大2號”四倍體率范圍為4.30%—37.82%(圖3)。受精24h時, CB濃度對長牡蠣“海大2號”四倍體率有顯著的影響(P＜0.05), 在CB濃度為0.7 mg/L時四倍體率顯著低于其他CB濃度, 四倍體率和CB濃度沒有表現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系。起始誘導時間能顯著影響長牡蠣“海大2號”四倍體率(P＜0.05), 起始誘導時間為15min時, 可以顯著提高四倍體率。在實驗設(shè)置的誘導持續(xù)時間的范圍內(nèi), 誘導持續(xù)時間沒有對長牡蠣“海大2號”四倍體率產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。CB濃度、起始誘導時間和誘導持續(xù)時間三者的交互作用對長牡蠣“海大2號”四倍體率有顯著影響(P＜0.05)。長牡蠣“海大2號”在CB濃度為0.5 mg/L、起始誘導時間為15min及誘導持續(xù)時間為20min時, 長牡蠣“海大2號”四倍體率出現(xiàn)最大值, 為37.82%。

2.3 CB濃度、起始誘導時間及誘導持續(xù)時間對誘導長牡蠣“海大2號”四倍體的D形幼蟲率的影響

在不同誘導條件下, D形幼蟲率為0.73%—47.22%(圖4)。受精24h時, CB濃度對D形幼蟲率有顯著的影響(P＜0.05), CB濃度為0.3 mg/L時, D形幼蟲率顯著高于其他CB濃度, 隨CB濃度增加, D形幼蟲率呈逐漸下降的趨勢, 且在CB濃度為0.9 mg/L時,D形幼蟲率最低。誘導持續(xù)時間顯著影響D形幼蟲率(P＜0.05), 且誘導持續(xù)時間與D形幼蟲率存在負相關(guān)的關(guān)系, D形幼蟲率隨誘導持續(xù)時間的增加而降低。起始誘導時間對D 形幼蟲率影響顯著(P＜0.05), 起始誘導時間為5min時, D形幼蟲率顯著高于起始誘導時間為10min和15min。但是三者的交互作用對誘導長牡蠣“海大2號”四倍體率影響不顯著(P＞0.05)。

3 討論

圖3 不同CB濃度、起始誘導時間及誘導持續(xù)時間對長牡蠣“海大2號”四倍體率的影響Fig.3 Effects of different CB concentrations, initial induction times and induction durations on tetraploid rate of C.gigas “Haida 2”

圖4 不同CB濃度、起始誘導時間及誘導持續(xù)時間對誘導長牡蠣“海大2號”四倍體D形幼蟲率的影響Fig.4 Effects of different CB concentrations, initial induction times and induction durations on D larvae rate of C.gigas “Haida No.2”

除了一些可控的因素外, 卵子發(fā)育同步性對四倍體率的影響不容忽視[13]。本研究為了降低卵子同步性對四倍體誘導結(jié)果的影響, 實驗親貝采用同一批人工繁育且同步促熟的長牡蠣“海大2號”二倍體, 以盡可能保證親貝性腺發(fā)育成熟程度的同步性。受精24h幼蟲群體的倍性檢測結(jié)果表明, 直接誘導長牡蠣“海大2號”二倍體的受精卵可以獲得其四倍體幼蟲, 而且CB濃度、起始誘導時間及誘導持續(xù)時間對長牡蠣“海大2號”四倍體率有顯著影響。對CB濃度、起始誘導時間及誘導持續(xù)時間進行優(yōu)化, 在一定程度上可以提高幼蟲四倍體率。CB濃度對長牡蠣“海大2號”四倍體率和D形幼蟲率均有顯著影響, 隨著CB濃度增加, D形幼蟲率逐漸降低, 說明隨著CB濃度的增加, 其誘導作用逐漸增強, 但是四倍體率并沒有隨之增加, 而是CB濃度為0.7 mg/L時的四倍體率低于CB濃度為0.5 mg/L的四倍體率。其原因可能是隨著CB濃度增加, CB毒性作用增強, 導致幼蟲的死亡率上升, 而存活幼蟲中四倍體幼蟲的相對比例并沒有提高, 而且倍性檢測對象是存活幼蟲群體, 最終導致CB濃度增加而四倍體率沒有相應增加的現(xiàn)象。這說明并不是CB濃度越高, 誘導效果越好。起始誘導時間可以顯著影響長牡蠣“海大2號”四倍體率和D形幼蟲率, 四倍體率在起始誘導時間為15min高于其他起始誘導時間, 說明同一批受精卵有一個相對集中釋放第一極體的時期, 在該時期對受精卵進行誘導處理, 可以高效的抑制受精卵第一極體釋放, 從而獲得較高的四倍體率。起始誘導時間為15min時的D形幼蟲率顯著低于起始誘導時間為5min的D形幼蟲率, 表明CB對不同發(fā)育時期的受精卵的作用程度不同,CB對受精15min后的受精卵的作用效果較為顯著。同時, 在起始誘導時間為15min時, 四倍體率較高而D形幼蟲率較低, 說明有效抑制受精卵第一極體釋放會導致D形幼蟲率的降低。誘導持續(xù)時間對長牡蠣“海大2號”四倍體率沒有顯著影響, 而對D形幼蟲率有顯著影響, 一方面說明誘導持續(xù)時間對四倍體率和D形幼蟲率的影響有明顯的差異, 另一方面也說明不能通過降低D形幼蟲率來提高四倍體率。另外, 誘導持續(xù)時間對長牡蠣“海大2號”四倍體率沒有顯著影響, 也可能是誘導持續(xù)時間梯度小導致的[15]。

染色體計數(shù)結(jié)果顯示在同一個處理中存在不同倍性的長牡蠣“海大2號”胚胎細胞, 這在很大程度上是由卵子發(fā)育不同步導致的。在單個牡蠣卵子數(shù)量可以滿足實驗需求的情況下, 可以采用對單個牡蠣的卵子進行誘導, 避免不同牡蠣之間卵子發(fā)育不同步對誘導的影響, 提高目標倍性的誘導效果[12]。染色體計數(shù)發(fā)現(xiàn)的一些非整倍體, 可能是染色體的不同分離方式導致的[16]。幼貝檢測結(jié)果表明, 由長牡蠣“海大2號”二倍體的受精卵直接誘導其四倍體是可行的, 但是存在四倍體率低的問題。造成這種情況的原因, 一方面可能是CB誘導導致幼蟲染色體異常增加, 很多無法適應染色體異常增加的四倍體幼蟲在生長過程中逐漸死亡; 另一方面, 與正常二倍體相比, 四倍體幼蟲生長速度較慢[9], 當誘導處理組的大多數(shù)幼蟲變態(tài)附著后, 仍有大部分四倍體幼蟲未能變態(tài)附著, 并且由于后期附著環(huán)境變差,導致一定比例的四倍體幼蟲不能完成變態(tài)附著。在已有的關(guān)于貝類四倍體的誘導研究中, 不僅出現(xiàn)幼蟲培養(yǎng)過程中四倍體幼蟲比例逐漸下降的問題[10], 而且變態(tài)附著后的養(yǎng)成過程中也存在幼貝四倍體率降低的現(xiàn)象[17]。即使采用物理方法誘導牡蠣四倍體, 也同樣出現(xiàn)高死亡率[18]。由貝類二倍體直接誘導其四倍體, 高死亡率是一個較為普遍的現(xiàn)象。

綜上所述, 本研究分析了CB濃度、起始誘導時間及誘導持續(xù)時間對誘導長牡蠣“海大2號”四倍體的影響, 篩選出較為適宜的長牡蠣“海大2號”四倍體的誘導條件為CB濃度0.5 mg/L, 起始誘導時間15min和誘導持續(xù)時間20min, 而且在該條件下獲得了長牡蠣“海大2號”四倍體幼貝。研究結(jié)果為培育長牡蠣“海大2號”四倍體提供了重要的基礎(chǔ)資料。