克氏原螯蝦嗜水氣單胞菌噬菌體的分離鑒定和應(yīng)用

霍詩天 焦厚琪 李 清 顧澤茂 劉學(xué)芹

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)系, 武漢 430070; 2.湖北省水生動(dòng)物病害防控工程技術(shù)研究中心, 武漢 430070;3.水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 武漢 430070)

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門, 甲殼綱, 十足目, 爬行亞目, 螯蝦科。隨著克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展, 克氏原螯蝦的病害問題也隨之增多, 其中一些疾病暴發(fā)原因尚不明確,疾病防治也只是采用一些常規(guī)水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治手段, 缺少針對(duì)克氏原螯蝦病害的有效措施, 致使養(yǎng)殖產(chǎn)量銳減, 目前國內(nèi)報(bào)道引起克氏原螯蝦大規(guī)模發(fā)病的病原主要有嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilia)[1]、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)[2]和弗氏檸檬酸桿菌(Citrobcter freundii)[3]等。

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)隸屬于弧菌科(Aeromondaceae)、氣單胞菌屬(Aeromonas)[4,5],是有運(yùn)動(dòng)能力, 兩端鈍圓, 極端單鞭毛的革蘭氏陰性桿菌[6]。在感染魚類后主要引發(fā)細(xì)菌性敗血癥和腸炎, 還能夠引起皮膚潰爛和壞死等癥狀[7], 是淡水養(yǎng)殖中重要的條件致病菌, 能引起斑點(diǎn)叉尾鮰、草魚、青魚、團(tuán)頭魴和鯽等多種淡水養(yǎng)殖魚類出血性敗血癥的暴發(fā)[8]。該病原對(duì)克氏原螯蝦也有較大的危害, 感染嗜水氣單胞菌的克氏原螯蝦在發(fā)病初期無明顯癥狀, 感染后期不攝食, 反應(yīng)遲鈍, 應(yīng)激能力減弱, 螯足及附肢無力, 解剖后可見肝胰腺顏色淡黃, 腹節(jié)背部肌肉蒼白[9], 可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

噬菌體是病毒的一種, 其特別之處是以細(xì)菌、支原體、螺原體和藍(lán)細(xì)菌等為宿主的病毒[10], 因此又被稱為細(xì)菌病毒, 廣泛存在于自然界中[11—13]。由于現(xiàn)在抗生素的大量使用, 致使許多細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性, 甚至出現(xiàn)了許多的超級(jí)細(xì)菌。由于噬菌體專一性等特點(diǎn), 噬菌體治療逐漸被應(yīng)用, d’Herelle[14—16]和Twort[17]最早通過治療實(shí)驗(yàn)證實(shí)了噬菌體的安全性, 并且證實(shí)噬菌體具有治療細(xì)菌病的作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 細(xì)菌性疾病自始至終是制約大規(guī)模養(yǎng)殖的一個(gè)重要因素, 抗生素的長(zhǎng)期使用使許多細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性, 因此在抗生素治療無效后, 噬菌體治療成為一個(gè)首選的治療方案。

嗜水氣單胞菌噬菌體在國內(nèi)外已有較多研究,我國于1994年首次分離出嗜水氣單胞菌噬菌體[18]。王志麗等[19]從中華鱉中分離到嗜水氣單胞菌噬菌體, 前者對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了研究, 后者發(fā)現(xiàn)分離的噬菌體對(duì)嗜水氣單胞菌具有明顯的抑制效果[20]。在治療實(shí)驗(yàn)中, 高珊珊[21]通過動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)估了噬菌體療法的安全性和有效性, 一些實(shí)驗(yàn)表明, 在用噬菌體處理感染細(xì)菌的泥鰍以后, 泥鰍的死亡率顯著下降[22], 用噬菌體治療感染細(xì)菌的斑馬魚后, 其存活率顯著提高[23]。此外, 新研發(fā)的新型噬菌體制劑BAFADOR?對(duì)魚類機(jī)體具有良好的耐受性, 可刺激細(xì)胞和體液免疫, 降低嗜水氣單胞菌感染后歐洲鰻的死亡率[24]。而且有些噬菌體對(duì)細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)于抗生素, 并且在使用之后沒有出現(xiàn)不良的免疫反應(yīng)[25]。對(duì)于一些攜帶內(nèi)源性抗生素耐藥基因的嗜水氣單胞菌臨床分離株引起的生物膜, 所分離到的一些新型噬菌體證明能夠?qū)ζ湓斐捎行У钠茐腫26]。

因此, 本研究以本課題組之前從患病克氏原螯蝦組織中分離到的致病性嗜水氣單胞菌Ah-0為宿主菌, 對(duì)從湖泊河流中分離到的一株烈性噬菌體Ph-0進(jìn)行了分離和鑒定, 及生物學(xué)特性的分析, 隨后研究了噬菌體Ph-0對(duì)人工感染Ah-0克氏原螯蝦的保護(hù)效果研究。以期為噬菌體治療克氏原螯蝦細(xì)菌性疾病的防治和治療提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

嗜水氣單胞菌Ah-0于本實(shí)驗(yàn)室保存。

健康克氏原螯蝦購自武漢白沙洲水產(chǎn)品市場(chǎng),體長(zhǎng)11.0—14.0 cm, 體重30.0—38.0 g, 水族箱中盛入少量水, 暫養(yǎng)1周以后, 挑選無異常健康的克氏原螯蝦供試驗(yàn)使用。

1.2 主要儀器與試劑

本研究使用的主要試劑(蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉等)、培養(yǎng)基(LB、LA、半固體等)、儀器(培養(yǎng)箱、搖床、離心機(jī)等)均參考文獻(xiàn)[19, 27]。

1.3 噬菌體的分離及純化

分離步驟參考文獻(xiàn)[27—29], 首先將采集的水樣經(jīng)無菌紗布過濾掉明顯的雜質(zhì), 再5000 r/min, 離心10min后, 收集上清, 得到噬菌體的原液; 取噬菌體原液300 mL, 加入到3倍營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的LB液體培養(yǎng)基中, 加入宿主菌, 培養(yǎng)4—6h, 收集菌懸液5000 r/min,離心10min, 收集上清液, 即得到增殖后的噬菌體原液。取噬菌體原液200與500 μL的嗜水氣單胞菌Ah-0混合, 室溫放置10min后與8 mL LB半固體培養(yǎng)基混合均勻, 傾倒于LB固體培養(yǎng)基上, 待凝固后,倒置放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12—24h, 直到出現(xiàn)噬菌斑。用接種環(huán)挑取形態(tài)大小有明顯差異的噬菌斑,純化3次。純化后的噬菌體按8∶2的比例加入噬菌體和甘油, -80℃保存。

1.4 噬菌體生物學(xué)特性的測(cè)定

最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定: 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌懸液, 分別加入MOI值為0.0001、 0.001、0.01、0.1、1、10、100的噬菌體原液, 放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中, 28℃, 180 r/min震蕩培養(yǎng)8h, 5000 r/min離心10min, 收集上清液。雙層平板法測(cè)定噬菌體的滴度, MOI值最高的即為噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)。

一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定: 以感染復(fù)數(shù)為0.1 MOI加入宿主菌和噬菌體, 放置于28℃恒溫水浴鍋中培養(yǎng)20min, 使噬菌體充分的吸附在宿主菌上; 之后12000 r/min離心5min, 去除上清液。加入1 mL LB培養(yǎng)基懸浮菌體沉淀, 重復(fù)離心, 去上清2次, 去除未吸附的噬菌體。最后用5 mL LB液體培養(yǎng)基重懸沉淀, 放置于28℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 并開始計(jì)時(shí), 每隔10min取樣100 μL, 直到3h后停止, 用雙層平板法測(cè)定噬菌體的滴度。最后以感染時(shí)間為橫坐標(biāo), 噬菌體的滴度為縱坐標(biāo)繪制噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線, 得出噬菌體的潛伏期、裂解期。

噬菌體的熱穩(wěn)定性: 將等量的噬菌體原液分裝于EP管中, 分別于4℃、20℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用1h。在時(shí)間結(jié)束后, 立刻取出, 測(cè)定噬菌體的滴度。

噬菌體的pH穩(wěn)定性: 按10%的比例將噬菌體加入pH分別為3、5、7、9、11的培養(yǎng)基中。28℃水浴1h。測(cè)定噬菌體的滴度。

噬菌體對(duì)紫外線的敏感性: 將噬菌體置于紫外燈下進(jìn)行照射, 時(shí)間分別為10s、20s、30s、1min、2min、3min、6min、9min、12min、15min、18min和21min, 測(cè)定噬菌體的滴度。

噬菌體對(duì)氯仿的敏感性: 取1 mL的噬菌體原液, 加入終濃度為5%的氯仿, 28℃水浴, 時(shí)間分別為0、3min、6min、9min、12min、15min和18min,測(cè)定噬菌體的滴度。

1.5 噬菌體核酸基因組片段大小鑒定

取純化的噬菌體顆粒, 采用《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)中λ噬菌體DNA提取方法提取噬菌體核酸, 將提取的噬菌體核酸在8 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。

1.6 嗜水氣單胞菌Ah-0對(duì)克氏原螯蝦LC50的測(cè)定

注射實(shí)驗(yàn)設(shè)置102—108CFU/mL 7個(gè)等比濃度梯度的菌液, 每組投放克氏原螯蝦10只, 腹部注射, 20 μL/只蝦, 此外注射等量的PBS作為對(duì)照,每隔6—12h觀察一次, 并對(duì)于死亡數(shù)進(jìn)行記錄, 在試驗(yàn)結(jié)束后, 將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 采用寇氏法計(jì)算菌株Ah-0 72h內(nèi)的LC50。

浸泡實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)濃度梯度和一個(gè)對(duì)照組,濃度為0和1×107—3.2×108CFU/mL六個(gè)等比濃度梯度菌液, 每組投放克氏原螯蝦20只, 每24h換一次菌液, 每隔6—12h觀察一次, 在試驗(yàn)結(jié)束后, 將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 采用寇氏法計(jì)算菌株Ah-0 72h內(nèi)的LC50。

1.7 噬菌體Ph-0的對(duì)克氏原螯蝦的安全性試驗(yàn)

克氏原螯蝦腹節(jié)背部注射不同滴度的噬菌體原液20 μL, 噬菌體的滴度為104—108PFU/mL 5個(gè)等比濃度梯度的噬菌體, 對(duì)照組注射等量PBS 緩沖液, 每組投放克氏原螯蝦10只, 每隔6—12h觀察其行為和癥狀, 72h后剖檢觀察體內(nèi)器官的臨床變化并選其鰓、肝胰腺、心臟做切片觀察病理變化。

1.8 噬菌體治療人工感染克氏原螯蝦試驗(yàn)

注射噬菌體注射治療人工感染克氏原螯蝦試驗(yàn)分為6組, 兩組對(duì)照組包括空白對(duì)照PBS組和攻毒Ah-0組, 菌液注射濃度為2.1×107CFU/mL,腹節(jié)背部注射20 μL/只, 設(shè)置4個(gè)治療梯度, 分別注射0.001、0.01、0.1和1 MOI的噬菌體, 腹節(jié)背部注射20 μL/只, 每組投放克氏原螯蝦10只, 每隔6—12h觀察其行為和癥狀, 將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 72h后剖檢觀察體內(nèi)器官的臨床變化并選其鰓、肝胰腺、心臟做切片觀察病理變化。

浸泡噬菌體浸泡治療人工感染克氏原螯蝦試驗(yàn)分為6組, 兩組對(duì)照組包括空白對(duì)照組和攻毒Ah-0組, 菌液浸泡濃度為3.5×108CFU/mL, 設(shè)置4個(gè)治療梯度, 分別加入0.001、0.01、0.1和1 MOI的噬菌體, 每組投放克氏原螯蝦20只, 每隔6—12h觀察其行為和癥狀, 將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 試驗(yàn)結(jié)束后剖檢觀察體內(nèi)器官的臨床變化并選其鰓、肝胰腺、心臟做切片觀察病理變化。

1.9 組織病理觀察

取克氏原螯蝦的鰓、心臟、肝胰腺于4%的多聚甲醛中, 固定24h后送武漢百仟度生物科技有限公司進(jìn)行HE染色并拍照。

2 結(jié)果

2.1 噬菌分離和純化

以Ah-0為宿主菌分離純化到一株烈性噬菌體,將其命名為Ph-0。在28℃恒溫培養(yǎng)箱中與宿主菌Ah-0共培養(yǎng)12h后可形成具有明顯邊界的圓形噬菌斑, 經(jīng)測(cè)量, 噬菌斑的直徑約為4 mm, 外層存在1 mm左右的半透明暈環(huán)(圖1)。

2.2 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)

如表1所示, 在與宿主菌共培養(yǎng)4h后, 當(dāng)MOI為0.1時(shí), 噬菌體Ph-0的滴度最高, 為4.85×107PFU/mL,因此噬菌體Ph-0的最佳感染復(fù)數(shù)為0.1 MOI。

2.3 噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線

圖1 噬菌體Ph-0噬菌斑形態(tài)Fig.1 Plaques shape of phage Ph-0

表1 噬菌體Ph-0的最佳感染復(fù)數(shù)Tab.1 The optimal MOI of phage Ph-0

圖2 噬菌體Ph-0的一步生長(zhǎng)曲線Fig.2 One-step growth curve of phage Ph-0

如圖2所示, 噬菌體 Ph-0的潛伏期約持續(xù)20min, 裂解期約持續(xù)70min, 90min后進(jìn)入平臺(tái)期。

2.4 噬菌體的熱穩(wěn)定性

如圖3所示, 從結(jié)果中可以看出, 當(dāng)溫度處于4—40℃時(shí)噬菌體的滴度無明顯變化, 當(dāng)溫度上升到50℃時(shí)噬菌體滴度下降到1×106PFU/mL左右, 當(dāng)溫度大于等于60℃, 噬菌體Ph-0的滴度出現(xiàn)明顯的降低, 當(dāng)溫度超過70℃時(shí), 已經(jīng)觀察不到明顯的噬菌斑。

2.5 噬菌體的酸堿穩(wěn)定性

如圖4所示, 在經(jīng)過梯度PH處理后, 噬菌體的活性在pH 3—11沒有太大的變化, 相對(duì)穩(wěn)定, 噬菌體Ph-0的滴度仍保持在1× 107PFU/mL左右, 與pH=7相比較, 在pH=3時(shí), 噬菌體的滴度下降到1×106PFU/mL左右, 在pH=11時(shí), 噬菌體的滴度下降到1×105PFU/mL左右, 總體來說, pH在3—9時(shí),所分離噬菌體的滴度范圍處于1×106—1× 107PFU/mL,未出現(xiàn)明顯的改變。

2.6 噬菌體對(duì)紫外線的敏感性

圖3 噬菌體Ph-0的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermo-stability of phage Ph-0

圖4 噬菌體Ph-0的酸堿穩(wěn)定性Fig.4 The pH stability of Ph-0

結(jié)果表明經(jīng)過不同時(shí)間的紫外線處理后(圖5),噬菌體的活性有明顯的變化, 從結(jié)果中可以看出,當(dāng)在紫外線處理3min后, 噬菌體的滴度從107降到102PFU/mL左右, 在紫外線處理9min后, 在平板上已經(jīng)觀察不到明顯的噬菌斑。

2.7 噬菌體對(duì)氯仿的敏感性

噬菌體經(jīng)有機(jī)試劑氯仿處理后(圖6), 噬菌體的活性受氯仿的影響很大, 結(jié)果顯示, 當(dāng)處理時(shí)間為3min時(shí), 當(dāng)時(shí)間達(dá)到6min時(shí), 只能形成幾個(gè)噬菌斑, 當(dāng)處理時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng), 已經(jīng)無法形成明顯的噬菌斑。

2.8 噬菌體核酸類型的鑒定

噬菌體基因組利用蛋白酶K/SDS的方法提取,由圖7可知, 噬菌體Ph-0核酸基因組能被DNaseⅠ完全降解而不能被RNase A和Mung Bean Nuclease降解, 因此噬菌體Ph-0的核算類型為雙鏈DNA。

2.9 嗜水氣單胞菌對(duì)克氏原螯蝦在72h之內(nèi)的LC50

采用注射法, 嗜水氣單胞菌對(duì)克氏原螯蝦在72h之內(nèi)的LC50為1.5×106CFU/mL; 采用浸泡法, 嗜水氣單胞菌對(duì)克氏原螯蝦在72h之內(nèi)的LC50為5.6×107CFU/mL。

2.10 噬菌體對(duì)克氏原螯蝦的安全性試驗(yàn)結(jié)果

圖5 紫外線對(duì)噬菌體活性的影響Fig.5 The effect of UV on the phage activity

圖6 氯仿對(duì)噬菌體活性的影響Fig.6 The effect of trichloromethane on the phage activity

克氏原螯蝦在注射噬菌體Ph-0后, 各濃度下都沒有死亡, 在解剖以后, 各組織從觀察結(jié)果來看與陰性對(duì)照組在表觀上沒有明顯的差別, 由圖8的組織切片可知, 與注射PBS的陰性對(duì)照組相比, 注射噬菌體后克氏原螯蝦的鰓、心臟和肝胰腺均未出現(xiàn)明顯的病理變化, 未對(duì)上述器官造成明顯的損傷,說明該噬菌體對(duì)克氏原螯蝦沒有明顯的毒性。

2.11 噬菌體注射治療對(duì)人工感染嗜水氣單胞菌的克氏原螯蝦的保護(hù)效果

圖7 噬菌體Ph-0基因組瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.7 Agarose gel electrophoresis of Ph-0 genomic

從圖9中可看出, 在只注射嗜水氣單胞菌的攻毒組中, 克氏原螯蝦全部死亡, 而經(jīng)過噬菌體Ph-0注射治療組中, 均有一定的保護(hù)效果, 對(duì)感染嗜水氣單胞菌的克氏原螯蝦的保護(hù)作用與噬菌體Ph-0的濃度有關(guān), 當(dāng)噬菌體的濃度達(dá)到3.5×106CFU/mL時(shí), 對(duì)于克氏原螯蝦的保護(hù)效果最好, 保護(hù)效率可以達(dá)到66%。

2.12 噬菌體注射治療對(duì)人工感染嗜水氣單胞菌的克氏原螯蝦的病理觀察

鰓組織的病理變化: 由圖10可知, 對(duì)照組中正常克氏原螯蝦的鰓絲結(jié)構(gòu)完整, 排列整齊, 鰓絲內(nèi)細(xì)胞分布均勻, 無聚集現(xiàn)象(圖10A); 感染細(xì)菌組克氏原螯蝦的鰓絲有斷裂出現(xiàn), 鰓絲略顯腫大, 大量細(xì)胞脫落死亡, 造成組織空泡化現(xiàn)象, 有多處明顯的血淋巴細(xì)胞浸潤(rùn), 此外角質(zhì)膜也有增厚的現(xiàn)象(圖10B); 在治療組Ah+Phage中, 雖仍有細(xì)胞聚集的現(xiàn)象, 但沒有出現(xiàn)大量的血淋巴細(xì)胞浸潤(rùn), 細(xì)胞間界限明顯, 鰓絲除部分邊緣模糊外, 整體保持完整, 無斷裂現(xiàn)象, 角質(zhì)膜的厚度也恢復(fù)到正常水平,總體結(jié)構(gòu)保持完整(圖10C)。

心臟組織的病理變化: 對(duì)照組正常克氏原螯蝦的心臟結(jié)構(gòu)完整, 肌絲均勻排列(圖10D); 注射細(xì)菌組克氏原螯蝦的心臟肌絲排列不均與, 心肌纖維出現(xiàn)彎曲腫大且斷裂的現(xiàn)象, 橫紋肌模糊, 出現(xiàn)膿染血細(xì)胞(圖10E); 在治療組Ah+Phage中, 克氏原螯蝦心臟的結(jié)構(gòu)保持完成, 但心肌纖維腫大現(xiàn)象明顯,仍然有部分細(xì)胞聚集(圖10F)。

圖8 克氏原螯蝦注射噬菌體Ph-0后的組織切片觀察結(jié)果Fig.8 Tissue section observation of Procambarus clarkii after injection of phage Ph-0

肝胰腺組織的病理變化: 對(duì)照組正常克氏原螯蝦的肝胰腺肝小管間界限明顯清晰, 肝小管之間通過正常的結(jié)締組織連接, 細(xì)胞分布均勻飽滿, 形態(tài)正常(圖10G); 注射細(xì)菌組克氏原螯蝦的肝胰腺中無成型的細(xì)胞, 大量細(xì)胞死亡, 脫落, 使得組織中出現(xiàn)大量的空泡, 管腔中棕色顆粒物質(zhì)顏色加深且數(shù)量增多, 肝小管之間間隙明顯增大并且界限模糊不清, 肝小管及連接肝小管的結(jié)締組織全部壞死, 已經(jīng)無明顯的結(jié)構(gòu)特征(圖10H); 在治療組Ah+Phage中的肝胰腺基本恢復(fù)到正常的形態(tài), 部分細(xì)胞脫落死亡, 肝小管有收縮現(xiàn)象, 連接肝小管的結(jié)締組織部分被破壞(圖10I)。

2.13 噬菌體浸泡治療對(duì)人工感染嗜水氣單胞菌的克氏原螯蝦的保護(hù)效果

由圖11可知, 在對(duì)照組全部死亡的前提下, 只有當(dāng)加入噬菌體的量為0.1 MOI時(shí)有一定的保護(hù)效果, 保護(hù)效率20%左右。

圖9 克氏原螯蝦存活率及死亡時(shí)間Fig.9 Survival rate and time of death of Procambarus clarkii

圖10 組織切片觀察結(jié)果Fig.10 Observation results of tissue sections

2.14 噬菌體浸泡治療對(duì)人工感染嗜水氣單胞菌的克氏原螯蝦的病理觀察

鰓組織的病理變化: 對(duì)照組克氏原螯蝦的鰓絲結(jié)構(gòu)正常(圖12A); 細(xì)菌浸泡組克氏原螯蝦的鰓絲部分腫大, 鰓絲內(nèi)有大量細(xì)胞脫落死亡, 角質(zhì)膜增厚, 無明顯的血淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖12B); 在治療組Ah+Phage中, 死亡脫落的細(xì)胞減少, 鰓絲整體結(jié)構(gòu)保持完整, 只有少數(shù)角質(zhì)膜增厚(圖12C)。

心臟組織的病理變化: 對(duì)照組克氏原螯蝦的心臟結(jié)構(gòu)完整(圖12D); 注射細(xì)菌組克氏原螯蝦的心臟肌絲腫脹明顯, 心肌纖維彎曲腫大, 斷裂現(xiàn)象明顯, 橫紋肌模糊(圖12E); 在治療組Ah+Phage中, 克氏原螯蝦心臟中細(xì)胞的體積偏大, 心肌纖維腫大現(xiàn)象明顯, 仍然有部分細(xì)胞聚集(圖12F)。

肝胰腺組織的病理變化: 對(duì)照組正常克氏原螯蝦的肝胰腺組織結(jié)構(gòu)完整(圖12G); 細(xì)菌浸泡組克氏原螯蝦的肝胰腺中肝小管收縮, 肝小管之間的結(jié)締組織被破壞, 部分細(xì)胞體積增大, 有空泡化現(xiàn)象但無注射組明顯(圖12H); 在治療組Ah+Phage中肝小管之間的結(jié)締組織恢復(fù)正常, 細(xì)胞形態(tài)正常, 基本無死亡脫落現(xiàn)象, 整體結(jié)構(gòu)完整(圖12I)。

3 討論

對(duì)噬菌體進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定, 有助于了解所分離噬菌體的特點(diǎn), 進(jìn)而篩選出有應(yīng)用價(jià)值的噬菌體。本研究以本課題組之前從患病克氏原螯蝦分離到的致病性嗜水氣單胞菌為宿主菌, 從水體中分離到一株烈性噬菌體, 并命名為Ph-0, 經(jīng)過多次純化富集之后, 經(jīng)雙層平板培養(yǎng)可見形態(tài)為圓形,有明顯暈環(huán)的噬菌斑, 這與已報(bào)到的噬菌體相似[30]。溫度、pH和有機(jī)試劑等一些化學(xué)和物理因素對(duì)噬菌體的活性具有重要影響, 通過不同梯度的溫度水浴處理噬菌體Ph-0之后, 噬菌體的滴度從低溫到高溫有一個(gè)明顯的變化, 當(dāng)溫度低于40℃時(shí), 噬菌體Ph-0的滴度無明顯波動(dòng), 當(dāng)溫度大于50℃時(shí), 噬菌體Ph-0的滴度開始下降, 當(dāng)溫度大于70℃時(shí), 噬菌體無法形成明顯的噬菌斑。與王志麗等[19]分離到的噬菌體不同, 其分離到的嗜水氣單胞菌噬菌體在50℃時(shí)已經(jīng)失活。與Easwaran等[23]所分離的噬菌體的耐受溫度相似, 在60℃時(shí)噬菌體的滴度有所下降, 在80℃時(shí)已基本無噬菌斑。經(jīng)過不同梯度pH處理噬菌體后, 結(jié)果顯示所分離噬菌體Ph-0的滴度無論是在酸性還是在堿性的溶液中(pH3—11), 滴度無明顯的下降, 表明所分離噬菌體有耐酸耐堿的特性, 與Chandrarathna等[25]所分離的噬菌體對(duì)于溫度的耐受度相近, 相比于Easwaran等[23]所分離到的噬菌體(pH5—11)對(duì)于堿性環(huán)境更耐受。在經(jīng)過不同時(shí)間紫外處理后, 噬菌體的滴度下降迅速且明顯,在照射時(shí)間達(dá)到3min時(shí), 噬菌體已經(jīng)下降近5log噬菌體數(shù)目, 到9min之后, 已經(jīng)基本無噬菌斑的形成,這與已有研究報(bào)道的噬菌體等病毒對(duì)紫外線敏感的結(jié)論一致。用5%的氯仿處理不同時(shí)間的噬菌體,結(jié)果顯示, 噬菌體Ph-0對(duì)氯仿及其敏感, 在處理3min時(shí)噬菌體的滴度已經(jīng)大幅下降, 處理6min后,只能形成個(gè)別噬菌斑, 當(dāng)處理時(shí)間進(jìn)一步加長(zhǎng), 已經(jīng)無噬菌斑的形成。感染復(fù)數(shù)作為病毒感染與病毒產(chǎn)量的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn), 是一個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo), 在本研究中, 當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.1 MOI時(shí), 所增殖的噬菌體滴度最高, 即最佳感染復(fù)數(shù)為0.1 MOI。當(dāng)感染復(fù)數(shù)過高, 即宿主菌較少, 噬菌體比較多, 噬菌體的裂解量偏低的可能原因是噬菌體之間的相互競(jìng)爭(zhēng)和相互抑制造成[31]。一步生長(zhǎng)曲線對(duì)于噬菌體的研究和應(yīng)用具有重要的意義, 通過測(cè)定噬菌體一步生長(zhǎng)曲線, 可以使噬菌體產(chǎn)量達(dá)到最高值的同時(shí),也使得生產(chǎn)周期達(dá)到最短, 同時(shí), 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分越豐富, 子代噬菌體的裂解量可能會(huì)更大, 且潛伏時(shí)間也會(huì)相應(yīng)縮短[32]。經(jīng)過測(cè)定,所分離噬菌體的潛伏期時(shí)間適中, 持續(xù)時(shí)間約為20min, 裂解期持續(xù)70min, 在90min之后其生長(zhǎng)趨勢(shì)趨于穩(wěn)定。之前有研究表明, 潛伏期的長(zhǎng)短取決于噬菌體類型、宿主類型和環(huán)境條件[23]。本結(jié)果與以前報(bào)道的IHQ1噬菌體相似[33]。

圖11 克氏原螯蝦存活率及死亡時(shí)間Fig.11 Survival rate and time of death of Procambarus clarkii

本實(shí)驗(yàn)分別采用注射和浸泡兩種方法探究噬菌體的治療效果, 結(jié)果表明2種方式均有一定的保護(hù)效果。采用注射治療時(shí)的最好保護(hù)率可以達(dá)到66%, 浸泡方法為20%, 當(dāng)采用注射的方式進(jìn)行治療時(shí), 保護(hù)率相較于浸泡方式更高, 可能原因是采用注射法時(shí)噬菌體可直接進(jìn)入機(jī)體, 作用細(xì)菌, 而采用浸泡法時(shí), 進(jìn)入機(jī)體的噬菌體數(shù)量相對(duì)較少, 治療效果較差。組織切片結(jié)果顯示, 對(duì)照組中各組織損傷現(xiàn)象明顯, 與已有研究相似[34], 相比于對(duì)照組,治療組克氏原螯蝦的鰓中血淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少, 細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常, 細(xì)胞間界限明顯, 鰓絲整體保持完整; 治療組克氏原螯蝦肝胰腺中肝小管形態(tài)正常, 管與管之間的結(jié)締組織大部分保持正常, 細(xì)胞分布均勻且大小無異常變化。相比于攻毒組, 治療組克氏原螯蝦的心臟治療效果不明顯, 仍存在心肌纖維腫大, 細(xì)胞形態(tài)異常且聚集的現(xiàn)象。

噬菌體專一性強(qiáng)的特點(diǎn)是噬菌體治療的優(yōu)勢(shì),同時(shí)也是其不足之處, 由于大多數(shù)的噬菌體裂解譜范圍很窄[35], 在治療過程中很難找到合適的噬菌體,此外噬菌體的制備條件要求很高, 在噬菌體的增殖過程中, 需要利用其宿主菌來增殖相應(yīng)的噬菌體,宿主菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較高, 宿主菌才能增殖, 而且噬菌體裂解宿主菌后的裂解液里含有大量的細(xì)菌碎片及細(xì)菌的一些內(nèi)毒素等, 在實(shí)際的應(yīng)用中效果都會(huì)有影響[36]。以上問題也是導(dǎo)致噬菌體難以應(yīng)用的原因。因此要篩選出寬裂解譜的噬菌體或制備噬菌體雞尾酒, 實(shí)際應(yīng)用中制備成儲(chǔ)存周期長(zhǎng)且穩(wěn)定的噬菌體制劑, 以拌料和潑灑相結(jié)合的方式進(jìn)行使用[22], 從而達(dá)到治療細(xì)菌病的目的。

綜上所述, 本研究以嗜水氣單胞菌為宿主菌分離到一株烈性噬菌體, 對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了分析,并分別采用注射和浸泡2種感染和治療方式探究噬菌體的治療效果, 可以為克氏原螯蝦細(xì)菌性疾病的防治和治療提供依據(jù)。

圖12 組織切片觀察結(jié)果Fig.12 Observation results of tissue sections