HPLC技術對賀蘭山東麓釀酒葡萄中酚酸類物質的檢測方法研究

楊靜，趙子丹，牛艷，吳燕，王曉菁，張艷

(寧夏農產品質量標準與檢測技術研究所，寧夏 銀川 750002)

酚類物質作為葡萄中最豐富的次生代謝產物，具有抗炎、抗菌、抗氧化等功效[1-3]，主要分為類黃酮和非類黃酮兩大類。酚酸作為一種非類黃酮物質，以游離態和結合態2種形式存在于植物體中[4-8]。許多研究表明，酚酸具有清除自由基的作用，有很強的抗氧化能力。中國的鮮食葡萄產業發展迅速，種植面積不斷增加?，F階段，我國已基本形成寧夏賀蘭山東麓、新疆天山北麓等十大葡萄產區，其中以寧夏賀蘭山東麓為代表的西部產區近年來頗受關注[9-11]。它是繼河北昌黎、山東煙臺之后，第三個被國家認定為葡萄酒原產地保護認證的產區，是國際公認的釀酒葡萄最佳產區之一，屬于世界優質釀酒葡萄的種植“黃金地帶”[12-15]。宋文風等[4]對葡萄果實的酚酸提取進行了優化，使酚酸的提取方法簡單方便；張星星等[16-19]用UPLC技術快速測定葡萄酒中的酚類物質，使酚酸的檢測時間縮短。

本研究以賀蘭山東麓釀酒葡萄為主要研究對象，采用高效液相色譜技術，通過建立賀蘭山東麓釀酒葡萄中酚酸的組成和含量的檢測方法，分析酚酸在不同品種、產區中葡萄的組成分布和差異，為提高釀酒葡萄的品質提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)購自美國Fisher公司；乙酸乙酯、乙醚(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；超純水(過0.45 μm濾膜)；沒食子酸、原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸，為標準對照品(≥98%，國藥集團化學試劑有限公司)。購買釀酒葡萄作為實驗材料。

1.2 儀器與設備

Waters e2695液相色譜儀-配2487紫外檢測器(美國Waters公司)；電子天平(精度為0.000 1 g)；渦旋混勻器(德國MS3 digital)；KQ5200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；離心機(上海安亭TDL-40)；純水機(美國Millipore公司)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒DHG-9240A型)。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

本實驗以酚酸為標準對照品。準確稱取10.000 0 mg標準對照品(精確到0.000 1 g)，用10 mL甲醇配置成1 000 mg·L-1的標準母液，保存于-20 ℃。臨用前，用甲醇溶液稀釋成一系列質量濃度的標準品溶液(0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、30.0 mg·L-1)。

1.3.2 樣品前處理

采集的釀酒葡萄經純水清洗擦干后，用高速勻漿機勻漿后，放于-20 ℃避光保存。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent-ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量為10 μL；波長為280 nm。

表1 流動相配比及洗脫時間

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜條件的確定

2.1.1 流動相的確定

經高效液相色譜檢測發現，以甲醇/水、乙腈/水為流動相，均不能有效分離目標成分酚酸。以乙腈/0.1%甲酸水溶液為流動相，Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱可以有效分離目標成分酚酸(圖1)。

1—沒食子酸；2—原兒茶酸；3—4-羥基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。圖1 波長280 nm酚酸標準品的色譜

2.1.2 樣品前處理方法的優化

不同提取試劑對酚酸的提取。本研究選取乙腈、甲醇、乙酯乙酯+乙醚對釀酒葡萄中酚酸進行提取。用乙腈和甲醇作為提取試劑無法將酚酸完全分離且提取雜質較多，而用乙酸乙酯+乙醚提取，雜質較少，組分能完全分離且提取也比較完全(圖2)。

a—乙腈提?。籦—甲醇提??；c—乙酸乙酯+乙醚提?。?—沒食子酸；2—原兒茶酸；3—4-羥基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。圖2 不同提取試劑的酚酸色譜

不同提取方式對酚酸提取的影響。準確稱取5.00 g葡萄樣品，加入20 mL乙酸乙酯+乙醚(V/V，1/1)，分別采用勻漿2 min、超聲10 min、振蕩10 min對酚酸進行提取。提取后全部濃縮，2 mL甲醇定容，過0.22 μm濾膜，上機待測。結果表明，當采用振蕩提取時提取效果最好(圖3)。

圖3 提取方式對釀酒葡萄中酚酸含量的影響

不同稱樣質量對酚酸提取的影響。分別稱取1.00、2.00、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00 g葡萄樣品，對酚酸進行10.00 mg·kg-1的添加回收，加入20 mL乙酸乙酯+乙醚(V/V，1/1)振蕩10 min對酚酸進行提取，測定其回收率。當稱樣質量為5.00 g時，回收率最高，說明能將釀酒葡萄中的酚酸提取完全(圖4)。

圖4 稱樣質量對釀酒葡萄中酚酸含量的影響

2.1.3 釀酒葡萄樣品的高效液相色譜

通過確定的液相色譜條件和前處理條件對釀酒葡萄樣品中的酚酸進行檢測，得到樣品空白的色譜圖，結果表明，前述確定的色譜條件和前處理條件對空白樣品無干擾(圖5)。

1—沒食子酸；2—原兒茶酸；3—4-羥基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。圖5 釀酒葡萄中酚酸液相色譜

2.1.4 酚酸的標準曲線、線性范圍及檢出限將酚酸的標準溶液母液稀釋成0.2、0.5、1.0、5.0、10、30 mg·L-1的標準溶液系列，采用外標峰面積定量，以各酚酸的標準品的峰面積為縱坐標(y)，以其濃度為橫坐標(x)，各酚酸的回歸方程、相關數和方法檢出限如表2。在0.2～30.0 mg·L-1，各種酚酸在相應濃度范圍內線性關系良好，相關系數在0.999 3～1.000 0，檢出限為0.02～0.04 mg·kg-1。據此確定在實驗范圍內儀器響應信號與進樣量呈良好的線性關系。

表2 5種酚酸的標準曲線回歸方程、相關系數、檢出限

2.1.5 精密度

將同一酚酸標準混合溶液，按照確定的色譜條件連續進樣6次，測定各標準物質的峰面積，計算峰面積的相對標準偏差(RSD)來考察色譜方法的精密度。實驗結果表明：沒食子酸的RSD為0.25%，原兒茶酸的RSD為1.36%，4-羥基苯甲酸的RSD為3.58%，香草酸的RSD為4.67%，丁香酸的RSD為0.98%，充分說明該方法具有較高的精密度。

2.1.6 加標回收率

以釀酒葡萄品種赤霞珠為實驗材料，添加濃度分別為1.0、10.0、30.0 mg·L-1，每個濃度重復5次。采用已確定的前處理方法進行提取，經高效液相色譜檢測，計算樣品中酚酸的回收率。沒食子酸的平均回收率為73.3%～95.1%，RSD為2.4%～5.6%；原兒茶酸的平均回收率為75.3%～79.4%，RSD為1.8%～5.9%；4-羥基苯甲酸的平均回收率為73.9%～105.1%，RSD為4.0%～5.8%；香草酸的平均回收率為78.7%～91.1%，RSD為5.0%～7.8%；丁香酸的平均回收率為74.3%～78.4%，RSD為3.3%～5.0%(表3)。樣品的回收率、重復性均能滿足檢測要求，表明方法的準確度高、精密度好，完全能滿足釀酒葡萄中酚酸的檢測要求。

表3 5種酚酸組分的回收率實驗結果(n=5)

按照上述條件進行檢測，釀酒葡萄樣品空白及樣品中添加標準品的液相色譜圖，見圖6、圖7。

1—沒食子酸；2—原兒茶酸；3—4-羥基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。圖6 釀酒葡萄樣品空白色譜圖

1—沒食子酸；2—原兒茶酸；3—4-羥基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。圖7 釀酒葡萄樣品添加回收色譜圖(10.0 mg·L-1)

2.2 釀酒葡萄中酚酸含量

2.2.1 不同品種釀酒葡萄中酚酸含量

釀酒葡萄中主要酚酸為沒食子酸和丁香酸，而4-羥基苯甲酸、原兒茶酸和香草酸含量較低(圖8)。赤霞珠的酚酸含量最高，之后依次為梅鹿輒、黑比諾、蛇龍珠、桑嬌維賽、霞多麗、威代爾。沒食子酸、原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、香草酸和丁香酸最高的葡萄品種分別為赤霞珠(19.3 mg·kg-1)、霞多麗(3.7 mg·kg-1)、黑比諾(2.3 mg·kg-1)、黑比諾(3.8 mg·kg-1)、赤霞珠(26.5 mg·kg-1)。說明沒食子酸和丁香酸在一定程度上可以體現出釀酒葡萄中酚酸總含量情況。

圖8 不同品種釀酒葡萄中酚酸含量

2.2.2 不同產地釀酒葡萄中酚酸含量

圖9為紅寺堡匯達酒莊、永寧玉泉營、青銅峽御馬酒莊3個產區釀酒葡萄酚酸含量。蛇龍珠釀酒葡萄沒食子酸、原兒茶酸、香草酸和丁香酸在永寧玉泉營產區表現最好，分別為10.1、3.7、10.2、8.4 mg·kg-1，4-羥基苯甲酸在紅寺堡匯達酒莊產區表現最好，為0.35 mg·kg-1(圖9)；梅鹿輒釀酒葡萄沒食子酸、原兒茶酸、香草酸在永寧玉泉營產區表現最好，分別為11.5、9.0、4.5 mg·kg-1，4-羥基苯甲酸和丁香酸在青銅峽御馬酒莊產區表現最好，分別為0.64、22.8 mg·kg-1；赤霞珠釀酒葡萄沒食子酸、原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、香草酸和丁香酸在紅寺堡匯達酒莊產區表現最好，分別為19.3、2.9、0.95、2.5、26.5 mg·kg-1。

圖9 不同產地釀酒葡萄中酚酸含量

2.3 葡萄中酚酸的主成分分析

主成分分析的目的主要在于利用原變量間具有較強相關性的特點，對多變量進行降維，縮減成較少維度的數據，并且對降維后的特征指標進行線性變換，用少量指標反映原始大量數據所提供的大部分信息[20-21]。利用SPSS 25.0數據處理軟件對釀酒葡萄中的5種酚酸含量進行主成分分析，得到主成分的特征值、貢獻率和累積貢獻率(表4)。特征值>1的共計2個主成分，第1主成分的貢獻率為48.346%，第2主成分的貢獻率為26.888%，這2個成分的累積貢獻率為75.234%，說明2個主成分能很好的反映原始數據絕大部分信息，因此,構成釀酒葡萄酚酸組分特征的物質由最初5個降到了2個主成分，成功達到了降維目的。

表4 各主成分的特征值和累積貢獻率

第1主成分主要是由丁香酸和沒食子酸構成，第2主成分為4-羥基苯甲酸。得分系數反映各個指標對主成分影響程度的判定依據，通過得分系數將各個變量進行線性組合，建立關于第1主成分(Y1)和第2主成分(Y2)與丁香酸(X1)、沒食子酸(X2)、香草酸(X3)、原兒茶酸(X4)、4-羥基苯甲酸(X5)這5個變量得分系數模型(表5)。因此第1主成分可以提取為Y1=0.376X1+0.365X2+0.358X3+0.345X4-0.070X5；第2主成分可以提取為Y2=0.246X1+0.033X2-0.099X3-0.366X4+0.849X5。

表5 主成分載荷矩陣

3 小結與結論

本研究采用超高效液相色譜儀測定賀蘭山東麓7個品種釀酒葡萄中5種酚酸含量。樣品的回收率、精密度均能滿足檢測要求，表明方法的準確度高、精密度好，完全能滿足釀酒葡萄中酚酸的檢測要求。將本方法應用于不同品種中賀蘭山東麓釀酒葡萄的測定，結果表明不同品種釀酒葡萄的酚酸均有檢出。由于含量高的成分不一定代表釀酒葡萄酚酸主成分，因此,用主成分分析法進行分析，經分析提取出2種主成分，其累積貢獻率達到75.234%。第1主成分為丁香酸和沒食子酸，第2主成分為4-羥基苯甲酸。實驗采用統計學方法探討了釀酒葡萄中酚酸含量，為釀酒葡萄在今后葡萄酒釀制工藝提供了重要參考價值。