耐鉛植物內生菌的篩選及其促生機制研究

王紅珠，吳華芬，呂高卿，趙云磊，黃立斌，余敏豪，黃長江*

(1.溫州醫科大學，浙江 溫州 325000； 2.麗水市農林科學研究院，浙江 麗水 323000； 3.麗水市生產力促進中心，浙江 麗水 323000； 4.麗水學院，浙江 麗水 323000)

由于礦產資源的大量開發利用，各種化學農藥及化肥的廣泛使用，含重金屬的污染物通過各種途徑進入土壤，造成土壤重金屬污染日益嚴重。目前，植物修復技術因其與環境生態相協調等優勢，在治理重金屬污染方面具有巨大的應用前景[1-2]。該技術對重金屬富集植物的要求較高，大部分富集植物因適生范圍窄、根系擴展深度有限、植株整體生長緩慢等缺陷導致修復污染土壤所需要的時間漫長[3]。大量研究表明，植物內生菌具有促進植物生長、降低重金屬脅迫毒害植物等作用，在植物修復領域具有較好的應用潛力。張凱曄等[4]從田菁種子分離純化得到一株BacillusSC60內生菌，并證明該菌可分泌IAA、溶解無機磷、提高種子活力、促進胚根發育。Li等[5]從高粱根中發現內生細菌K3-2(Enterobactersp.)，能產ACC脫氨酶、IAA、鐵載體和精氨酸脫羧酶。盆栽試驗表明，菌株K3-2顯著提高了在銅礦廢棄地生長的蘇丹紅高粱的干重和根系銅積累量。

近年來，關于耐重金屬內生菌的研究主要集中在菌株的分離鑒定、促生特性檢測等方面，但關于產促生物質影響因素的研究卻鮮有報道。本試驗以重金屬超富集植物為材料，從中分離篩選出耐重金屬優勢內生菌，研究其促生特性及影響因素，并模擬重金屬污染環境，考察其實際促生效果，為內生菌植物聯合修復重金屬污染的研究提供理論依據，以推動內生菌在植物修復重金屬污染土壤工程中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

鉆葉紫苑、野茼蒿、牛筋草、博落回采集于麗水市水閣村重金屬污染較為嚴重的地區，大豆種子由麗水市農科院提供。

冷凍高速離心機(SIGMA Laborzentrifugen GmbH，3 K 15)，紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司，UV-4802)，原子吸收分光光度計(島津，AA-6300C)等。高氏一號培養基；LB液體培養基；PKO液體培養基；SA液體培養基等。

1.2 耐重金屬內生菌的初篩

將外表面消毒的植物組織碾磨并分別置于牛肉膏蛋白胨、馬丁氏和高氏等液體培養基中富集培養。吸取0.1 mL富集液涂布于含不同Pb2+濃度的上述3種培養基上，于30 ℃培養3～6 d后，挑取抗性優勢菌，純化后4 ℃保存。培養基Pb2+濃度分別為100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 mg·L-1。

1.3 耐重金屬內生菌的復篩

將初篩獲得的菌株接種到PKO平板、LB液體培養基(含100 mg·L-1色氨酸)和CAS平板上，28 ℃培養。每天觀察PKO培養基上溶磷圈的大小，判斷溶磷效果。用比色法檢測LB液體培養基，確定產IAA能力。以CAS平板上橙黃色透明圈大小確定產鐵載體能力。根據溶磷性、IAA與鐵載體的定性測定，篩選出優勢菌株。對篩選出的優勢菌株進行產ACC脫氨酶定性檢測[6]。

1.4 優勢抗性菌株的鑒定

觀察優勢抗性菌株的菌落形態、革蘭氏染色和芽孢染色結果，依據伯杰氏細菌鑒定手冊，鑒定其種屬。

1.5 優勢抗性菌株促生效果影響因素研究

各取1.5 mL菌懸液分別接種于15 mL LB、PKO、SA液體培養基中，于140 r·min-1、28 ℃培養72 h后測其IAA、可溶性磷和鐵載體含量。以單因素試驗考察初始接種量、Pb2+濃度和培養時間對優勢抗性菌株促生效果的影響。各因素水平設置如下：培養時間為1～8 d，重金屬Pb2+濃度分別為0、100、200、300、400、500、600、700 mg·L-1，產IAA試驗的接種量分別為2、3、4、5、6%，可溶性磷和產鐵載體試驗的接種量分別為4、7、10、13、16%。IAA定量檢測采用比色法，磷含量定量檢測參考陳超瓊[7]的方法，鐵載體定量檢測參考雷平[8]的方法。

1.6 優勢抗性菌株對大豆生長及其重金屬積累影響

試驗組用優勢抗性菌株侵染大豆種子，對照組用無菌水做相同處理，土培介質用含Pb2+的霍格蘭氏營養液處理，添加的Pb2+濃度為800 mg·kg-1。培養30 d后，測定大豆植株的生長參數，并用火焰法測定大豆植株的重金屬含量。

1.7 統計學處理

本試驗數據以均數表示。兩樣本之間的比較用t檢驗，多樣本之間的比較使用單因素或雙因素方差分析，數據統計分析作圖使用GraphPad Prism 7.0軟件。

2 結果與分析

2.1 耐重金屬內生菌的篩選與鑒定

本試驗從鉆葉紫苑等4種植物中共篩選出24株具有重金屬抗性的內生菌，其中3株為內生真菌，其余21株均為內生細菌，最高Pb2+耐受濃度為1 000 mg·L-1。對初篩分離的耐重金屬內生菌進行促生效果鑒定，結果表明，初篩分離出的24株耐重金屬內生菌中，13株能產IAA，17株能產鐵載體，6株具有溶磷效果。其中4株內生菌同時具備這3種能力，分別為MZ01、GZ01、GZ02、GY01菌株。菌株GZ01的IAA檢測變色最明顯，鐵載體變色圈和溶磷圈較大，分別為1.10和1.14 mm，且具有產ACC脫氨酶能力，能利用ACC為唯一氮源進行生長。因此，選定該菌株為后續試驗菌種。

耐重金屬內生菌GZ01菌落平展，近圓形，中央隆起，白色，有光澤，不透明，邊緣光滑(圖1)。該菌為革蘭氏陽性球菌(圖2)，2～4個菌連成鏈狀，不產芽孢(圖3)。依據伯杰氏細菌鑒定手冊判斷該菌為鏈球菌屬。

圖1 菌落形態

圖2 革蘭氏染色結果

圖3 芽孢染色情況

2.2 菌株GZ01促生效果的影響因素

2.2.1 初始接種量

不同接種量對菌株GZ01產IAA具有顯著影響，對溶磷效果和產鐵載體具有極顯著影響。接種量在2～3%時IAA含量逐漸上升，在3%～6%時IAA含量逐漸降低，IAA含量在接種量為3%時最高，為23.47 μg·mL-1(圖4)。鐵載體活性與磷含量均隨著接種量的增加先上升后下降，同時在接種量為10%時最高，分別為35.84%和8.80 μg·mL-1(圖5～6)。因初始接種量對代謝產物的合成有較大的影響，接種量小，延遲期較長，使繁殖時間延長，營養物質耗損過多，導致目的產物產量不高；接種量過大時，菌體迅速生長，溶氧量急劇減小，從而降低次級代謝產物的合成，故在最適接種量下，內生菌各產物產量最高。因此，內生菌GZ01產IAA的最適接種量為3%，溶磷效果與產鐵載體的最佳接種量均為10%。

圖4 接種量對菌株GZ01產IAA的影響

圖5 接種量對菌株GZ01產鐵載體的影響

圖6 接種量對菌株GZ01產可溶性磷的影響

2.2.2 重金屬Pb2+濃度

不同Pb2+濃度對菌株GZ01產IAA具有極顯著影響，對產鐵載體具有顯著影響。隨Pb2+濃度的增加，IAA含量增高，在500 mg·L-1時達到最大，之后Pb2+濃度增加，IAA含量趨于穩定(圖7)。表明內生菌產IAA的能力受Pb2+濃度誘導，且該誘導效果在Pb2+濃度為500 mg·L-1時達到最強。鐵載體活性單位隨Pb2+濃度的增加而增加，在Pb2+濃度為100～200 mg·L-1時活性穩定且保持較高，在Pb2+濃度超過200 mg·L-1后，活性下降，在濃度為200～400 mg·L-1，下降尤為明顯。在Pb2+濃度超過400 mg·L-1后，活性單位變化不明顯，但仍高于30%(圖8)。表明該菌產鐵載體能力受Pb2+誘導，在Pb2+濃度為200 mg·L-1時，該能力達到最強。過高Pb2+濃度刺激(Pb2+>200 mg·L-1)會抑制鐵載體的分泌，但即使在高濃度Pb2+下，GZ01仍可以產生活性較高的鐵載體(活性>30%)。由于重金屬鉛對可溶性磷化合物有很強的吸附性，能形成難溶性的磷酸化合物，影響試驗結果。因此，本試驗未涉及Pb2+濃度對可溶性磷含量的影響。

圖7 Pb2+濃度對菌株GZ01產IAA的影響

圖8 Pb2+濃度對菌株GZ01產鐵載體的影響

2.2.3 培養時間

不同培養時間對菌株GZ01溶磷、產IAA和鐵載體的能力具有極顯著影響。1～5 d，IAA含量上升，5～8 d，IAA含量降低，IAA含量在5 d達到最高值，為34.17 μg·mL-1(圖9)。因此，內生菌GZ01合成IAA最適培養時間為5 d。1～6 d培養液中鐵載體含量逐漸升高，在6 d達到頂峰，為88.41%。6 d之后鐵載體活性下降(圖10)?？芍獌壬鶪Z01產鐵載體最佳的培養時間為6 d?？扇苄粤缀侩S著時間的變化先升高后降低，在6 d達到最高峰，為35.41 μg·mL-1，此時溶液中大量難溶性磷轉化成可溶性磷，故溶磷效果最佳為6 d(圖11)。

圖9 培養時間對菌株GZ01產IAA的影響

圖10 培養時間對菌株GZ01產鐵載體的影響

圖11 培養時間對菌株GZ01產可溶性磷的影響

2.3 菌株GZ01對大豆生長及其重金屬積累的影響

模擬培養結果表明，接種GZ01的大豆植株在株高、莖葉鮮重、莖葉干重和Pb2+含量4個指標與對照組有極顯著差異(表1)。在添加Pb2+濃度為800 mg·kg-1的條件下，對照組植株體內Pb2+濃度為0.32 mg·g-1，染菌組植株體內Pb2+濃度為0.25 mg·g-1，比對照組低21.88%。且該處理條件下，染菌組的株高、莖葉鮮重、莖葉干重、根鮮重和根干重分別比對照組增加了137.44%、135.14%、83.33%、15.00%、78.57%?？梢姡词乖诟逷b2+濃度環境下，菌株GZ01仍對大豆的生長有明顯促進作用。推測該菌可能通過分泌IAA，產鐵載體等途徑,降低Pb2+對宿主植物的毒害使幼苗長勢良好。

表1 接種菌株GZ01后大豆生長參數的變化

3 討論

植物修復土壤重金屬污染以其高效、低廉、生態友好、無二次污染等優勢被認為是最有前景的修復技術。但該技術存在修復植物生長緩慢，低生物量等問題。如Hammer等[9]通過田間試驗發現，利用Thlaspicaerulescens修復土壤Cd2+需10 a時間。McGrath等[10]通過田間試驗結果發現，由于修復植物A.halleri的生物量較低，對Cd2+的吸收能力不強，導致其修復Cd2+污染效率低下。而植物修復土壤重金屬污染的關鍵在于提高富集植物的生物量[11]。故如何促進超富集重金屬植物的生長及生物量的增長是目前植物修復重金屬污染的重點。

本試驗在重金屬污染嚴重的地區采集植物樣本，從樣本中篩選得到1株耐鉛性較強的內生菌GZ01，經鑒定為鏈球菌屬(Streptococcus)。該菌最高可耐受700 mg·L-1Pb2+，且具有溶磷效果，產IAA、鐵載體和ACC脫氨酶等促生物質。各單因素試驗結果表明，菌株GZ01的各項促生特性受時間、Pb2+濃度和初始接種量等因素的影響。在初始接種量為3%、Pb2+濃度為500 mg·L-1條件下，培養5 d，該菌分泌IAA效果最好。在初始接種量為10%，培養6 d，該菌溶磷效果最好。在初始接種量為10%、Pb2+濃度為200 mg·L-1的條件下，培養6 d，該菌產鐵載體效果最好。劉麗輝等[12]研究表明，南方野生稻內生細菌JH50產IAA能力為29.97 mg·L-1。王維[13]的研究表明，內生菌分泌IAA隨時間變化先增加后驟然降低。田方等[14]從煙草根際分離出的G-229-21T可產鐵載體活性最高為82.30%，而本試驗中菌株GZ01的鐵載體活性最高可達到88.41%，比G-229-21T高6.11%，說明內生菌GZ01具有很強的促生優勢。

在模擬重金屬污染的條件下，菌株GZ01能降低宿主植物體內Pb2+濃度，對大豆植株的生長及生物量的積累起促進作用。促生效果影響試驗結果表明，菌株GZ01即使在高Pb2+濃度環境中，仍具有較強的產IAA和鐵載體的能力。說明該菌可能通過分泌IAA，產鐵載體等方式，調節植物生命活動，降低Pb2+對宿主植物的毒害。Babu等[15]從樟子松的根中分離得到了GSB-1菌株(Bacillusthuringiensis)。該菌株可產ACC脫氨酶、IAA和鐵載體等，并且增加了冷杉幼苗的生物量、葉綠素含量，提升了對含重金屬尾礦土壤的植物修復效果。萬勇[16]將鎘超富集植物龍葵內生菌DE5(Variovoraxparadoxu)接種于青葙，發現與未接種的空白對照組相比，青葙根部生物量增加了125.0%，對鎘的富集能力增強了81%。本文的結論與Babu等觀點一致，在添加Pb2+濃度為800 mg·kg-1的條件下，染菌組植株的莖葉干重和根干重分別比對照組提高83.33%和78.57%，表明菌株GZ01即使在高濃度的重金屬污染環境下，仍可大幅度提高宿主植物的生物量，為彌補植物修復的不足提供新的參考。

綜上所述，耐重金屬內生菌GZ01具有產IAA、鐵載體、溶磷等多項促生能力，在重金屬污染的環境中能促進宿主植物生長及生物量的增加，提高植物修復重金屬污染效率，可將其作為工程菌進行誘導，聯合植物共同修復重金屬污染。耐重金屬內生菌GZ01在植物體內的生命活動規律，以及在重金屬存在條件下與植物的協同作用機理及原位修復應用的實際效果有待進一步研究。