抗生素清腸對丁酸梭菌保護腸炎小鼠腸黏膜屏障的影響及初步機制研究

徐婧，徐豪明，周有連，彭瑤，趙沖，何杰，黃紅麗，趙海蘭，黃文琪，聶玉強

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種以反復腹痛、腹瀉為特征的炎癥性疾病，常呈慢性，主要包括克羅恩病(Crohn′s disease，CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)這兩個類型。IBD的發病原因復雜，目前認為主要與遺傳、環境、免疫和腸道菌群等有關。隨著微生物-宿主相互作用的深入研究，大量研究表明益生菌或糞菌移植等菌群干預方法可調節宿主腸道菌群、改善腸道屏障功能，進而發揮療效[1-4]。丁酸梭菌是一種以產丁酸為主要特點的專性厭氧菌，其產生的丁酸可直接為結腸細胞提供能量，緩解炎癥癥狀[5]。在菌群失調誘導的小鼠腹瀉模型中，丁酸梭菌可調節腸道菌群穩態，改善屏障功能和黏膜免疫細胞失調，促進小鼠恢復穩態[6]。在炎癥性疾病和自身免疫病中核轉錄因子NF-κB發揮重要作用，激活后的NF-κB可轉位入核，并顯著上調如TNF-α、IL-6、IL-1β等眾多促炎因子的表達，擴大機體炎癥級聯反應。此外，NF-κB抑制劑可明顯減弱腸上皮屏障功能損害[7]。適當應用抗生素可抑制部分腸道致病菌的過度增長，也有研究證實糞菌移植前應用抗生素可增強移植后菌群的定植。本實驗通過設置有無抗生素清腸預處理后葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)造模組，并給予丁酸梭菌干預。通過小鼠體質量、疾病活動指數、屏障改變情況和炎癥因子表達情況等指標，觀察聯合抗生素預處理后丁酸梭菌對DSS誘導小鼠結腸炎療效的作用，并初步探討丁酸梭菌對于腸黏膜屏障保護的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性Balb/c小鼠購買于廣東省醫學實驗動物中心(動物許可證號：SCXK[粵]2018-0002)，6～8周齡，體質量24～26 g，飼養于廣州市第一人民醫院動物實驗室。

1.2 實驗試劑

丁酸梭菌購于ATCC(ATCC 19398)；DSS購于美國MP biomedical公司；氨芐西林、萬古霉素、新霉素、甲硝唑購自合肥博美生物科技有限責任公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)、TB Green Premix Ex TaqⅡ(RR820A)購自日本Takara公司；兔抗鼠NF-κB p65單抗(#8242)、兔抗鼠磷酸化NF-κB p65單抗(#3033)、兔抗鼠IκBα單抗(#4812)和兔抗鼠磷酸化IκBα單抗(#2859)購自美國Cell Signaling TECHNOLOGY公司；兔抗鼠ZO-1多抗(ab216880)、兔抗鼠occludin多抗(ab168986)和兔抗鼠GAPDH單抗(ab181602)購自英國Abcam公司；羊抗兔HRP二抗(S0001)購自Affinity公司；小鼠ACTB內參引物購自上海生工公司(B661302-0001)。

1.3 腸炎小鼠模型的建立

進行1周的適應性飼養后，將30只小鼠隨機分為5組，具體為空白組(Control)、DSS組(DSS)、抗生素清腸+DSS組(DSS+Antibiotic)、DSS+丁酸梭菌組(DSS+CB)和抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組(DSS+Antibiotic+CB)。抗生素清腸方案為：四聯抗生素(氨芐西林1 g/L、新霉素1 g/L、萬古霉素0.5 g/L、甲硝唑1 g/L)作為飲用水，待自由飲用7 d后更換為正常飲用水3 d，并循環3次。將3%(w/w)DSS添加到飲用水讓小鼠自由飲用12 d，以構建急性結腸炎模型。每日據體質量下降程度、腹瀉情況及血便情況評分，并按公式DAI=(體質量評分+腹瀉評分+血便評分)/3計算DAI分數[8]。所培養出的丁酸梭菌活菌調整濃度為1×106CFU，于DSS造模期間用于干預組連續灌胃；空白組用等量生理鹽水灌胃作為對照。于實驗終點用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，頸椎脫臼法處死小鼠。新鮮結腸取出后分裝于1.5 mL EP管，并快速放入液氮；取靠近肛門約1 cm的直腸進行石蠟包埋切片及HE染色，并進行評分[9]。

1.4 細菌培養

沾取丁酸梭菌菌液后于TSA固體培養基平板劃線培養，并將該平板置于37 ℃溫箱厭氧孵育24 h。待出現可視菌落后，將其挑出并培養于TSB液體培養基中，繼而轉移到37 ℃溫箱厭氧培養14～16 h。待培養管底部出現3～5 mm乳白色沉淀時，將培養管以3 000 rpm/min轉速在4 ℃下離心5 min收集菌體，PBS洗滌菌體3次后，調整菌液濃度為1×106CFU。

1.5 指標檢測方法

1.5.1 RT-QPCR測定促炎因子表達水平 所用TNF-α、IL-1β因子引物由上海生工有限公司合成，具體序列為：TNF-α上游引物 5′-TTAGAAAGGGGATTATGGCTCA-3′，下游引物 5′-ACTCTCCCTTTGCAGAACTCAG-3′；IL-1β 上游引物 5′-AGAGCATCCAGCTTCAAATCTC-3′，下游引物 5′-CAGTTG-TCTAATGGGAACGTCA-3′。

用Trizol法提取組織總RNA，并據說明書使用Takara逆轉錄試劑進行cDNA的合成。QPCR的反應體系為10 μL SYBR Green Supermix，1 μL上游引物(10 μmol/L)，1 μL下游引物(10 μmol/L)，6 μL去離子水和2 μL的cDNA模板(50 ng/μL)。QPCR運行程序設定為95 ℃預變性20 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火延伸30 s，40個循環。確保每次結果中擴增產物溶解曲線為單峰，CT值在可信范圍內。

1.5.2 免疫組織化學檢測緊密連接蛋白表達 將已進行石蠟包埋切片的結腸組織依次進行脫蠟、修復、封閉，繼而由一抗與抗原特異性結合形成免疫復合物，4°過夜，抗體濃度為ZO-1抗體(1∶200)、Occludin抗體(1∶1 000)；復溫后孵育二抗40 min，用DAB顯色劑進行顯色，蘇木素復染，封片鏡檢。結果判定：陽性細胞為管腔、隱窩上皮細胞膜和上皮細胞連接處呈棕黃色的細胞。據切片染色的強度和所判定陽性細胞百分比分別進行評分；兩項相加為最終分數[10]。

1.5.3 Western-blot檢測NF-κB通路表達 結腸組織經RIPA+PMSF裂解、勻漿后，測蛋白濃度，配制5%、8%聚丙烯凝膠，取總蛋白40 μg上樣，電泳，PVDF轉膜，脫脂奶粉封閉后孵育一抗，4 ℃過夜，抗體濃度為NF-κB(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)；復溫后孵育二抗1.5 h；顯像。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 丁酸梭菌可改善結腸炎大體

由圖1可知，空白組小鼠體質量平穩增加，一般狀況良好。給予DSS造模后，DSS組小鼠于第2天體質量下降，并出現精神萎靡、毛發粗糙，以及肉眼血便、大便不成形等結腸炎表現；給予丁酸梭菌干預后，DSS+丁酸梭菌組小鼠體質量及一般狀況較DSS組稍緩解。給予DSS造模后，抗生素清腸+DSS組小鼠體質量從第2天起略微下降，自第7天起下降不明顯；但給予丁酸梭菌干預后，抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組小鼠體質量逐漸增加。

由圖1可知，實驗終點時，空白組小鼠疾病活動度趨近于0。DSS組小鼠DAI顯著增高(P<0.001)，給予丁酸梭菌干預后DAI降低。與空白組比較，抗生素清腸+DSS組DAI顯著增加(P<0.001)，而丁酸梭菌干預可明顯降低其DAI(P<0.01)。總的來說，抗生素清腸可加強丁酸梭菌降低DAI的效果。

圖1 各組小鼠體質量及末次DAI評分 A：體質量；B：末次DAI評分(**P<0.01，***P<0.001)

2.2 丁酸梭菌改善結腸炎小鼠腸道病理

由圖2可知，光鏡下空白組小鼠結腸黏膜結構完整，腺體排列整齊，可見大量杯狀細胞，黏膜固有層及黏膜下層未見明顯免疫細胞浸潤。DSS組及抗生素清腸+DSS組小鼠結腸黏膜結構破壞，腺體消失，黏膜固有層及黏膜下層出現大量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤；DSS組嚴重程度大于抗生素清腸+DSS組。給予丁酸梭菌干預后，干預組小鼠結腸黏膜結構較完整，腺體破損及免疫細胞浸潤緩解，可見杯狀細胞；抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組小鼠結腸病理程度較DSS+丁酸梭菌組輕。

圖2 各組小鼠結腸HE染色和病理評分 A：空白組；B：DSS組；C：DSS+抗生素清腸組；D：DSS+丁酸梭菌組；E：DSS+抗生素清腸組+丁酸梭菌組；F：組織病理評分(*P<0.05, ** P<0.01)

據結腸黏膜損傷程度和炎性細胞浸潤程度進行評分，可見與空白組相比，DSS組和抗生素清腸+DSS組病理評分顯著升高，且DSS組病理評分高于抗生素清腸+DSS組。給予丁酸梭菌干預后，DSS+丁酸梭菌組較DSS組病理評分降低(P<0.05)，抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組較抗生素清腸+DSS組病理評分均減低(P<0.01)，且后者病理評分較前者下降程度更高。

2.3 丁酸梭菌緩解腸道屏障損傷

ZO-1和occludin是重要的腸道屏障緊密連接蛋白，可間接反映腸屏障損害程度；其表達程度越高，屏障修復和抵御外界損傷能力越強[11]。如圖3所示，空白組小鼠結腸ZO-1表達顯著，其表達多位于管腔上皮細胞、隱窩上皮細胞、上皮細胞連接處頂端。與空白組相比，DSS組及抗生素清腸+DSS組ZO-1表達明顯減少，DSS組ZO-1表達減少程度重于抗生素清腸+DSS組。給予丁酸梭菌干預后，干預組管腔上皮細胞及隱窩上皮細胞ZO-1表達增強，且抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組表達增強最顯著。據染色強度和炎性細胞所占百分比進行評分，可見DSS組和抗生素清腸+DSS組ZO-1表達評分明顯降低(P<0.001；P<0.05)，而丁酸梭菌干預組評分均升高(P<0.05)。抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組評分在干預組中最高。

圖3 各組小鼠結腸ZO-1免疫組化染色及評分 A： 空白組；B：DSS組； C：DSS+抗生素清腸組； D：DSS+丁酸梭菌組； E：DSS+抗生素清腸組+丁酸梭菌組； F：免疫組化評分(*P<0.05, *** P<0.001)

如圖4所示，occludin在空白組的管腔上皮細胞、隱窩上皮細胞及上皮細胞連接處頂端均可觀察到表達，DSS組對比空白組其表達減少，抗生素清腸+DSS組occludin表達稍減少。給予丁酸梭菌干預后，干預組occludin表達增高(P<0.05)，其表達多位于管腔上皮細胞、隱窩上皮細胞、上皮細胞連接處頂端及少部分胞漿，且抗生素清腸后的抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組表達程度增高更明顯。從免疫組化評分來看，DSS組和抗生素清腸+DSS組評分較空白組明顯降低(P<0.001；P<0.05)，DSS組降低程度更顯著。給予丁酸梭菌干預后，DSS+丁酸梭菌組和抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組評分增加(P<0.05)。抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組評分為干預組中最高。

圖4 各組小鼠結腸occludin免疫組化染色及評分 A： 空白組；B：DSS組； C：DSS+抗生素清腸組； D：DSS+丁酸梭菌組； E：DSS+抗生素清腸組+丁酸梭菌組； F：免疫組化評分(*P<0.05, *** P<0.001)

2.4 丁酸梭菌下調促炎因子表達

據圖5可知，與空白組比較，DSS組和抗生素清腸+DSS組促炎因子TNF-α的相對表達增加，而DSS組增加更為明顯 (P<0.001)。給予丁酸梭菌干預后，干預組TNF-α相對表達量均下降，DSS+丁酸梭菌組TNF-α表達下調具有統計學差異(P<0.01)；抗生素清腸+DSS+丁酸梭菌組其TNF-α的相對表達量最低。促炎因子IL-1β在DSS組的相對表達量明顯增高(P<0.01)，給予丁酸梭菌干預后的DSS+丁酸梭菌組其表達顯著下降；但抗生素清腸后的抗生素清腸+DSS組IL-1β表達未見明顯升高。

圖5 小鼠結腸TNF-α和IL-1β相對表達量 A： TNF-α；B：IL-1β (*P<0.05，**P<0.01, *** P<0.001)

2.5 丁酸梭菌作用與NF-κB通路相關

如圖6所示，從P65表達情況來看，DSS組表達略低于空白組，兩者差異不大；抗生素清腸+DSS組表達降低較明顯(P<0.001)。DSS+丁酸梭菌組表達低于DSS組，差異均具有統計學意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達明顯低于DSS+抗生素清腸組，且差異具統計學意義(P<0.001)。從磷酸化P65表達情況來看，DSS組和抗生素清腸+DSS組表達明顯高于空白組，其差異具有統計學意義(P<0.001)。與DSS組相比，DSS+丁酸梭菌組表達低于DSS組，差異均具有統計學意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達略升高，且差異具統計學意義(P<0.01)。從IκBα表達情況來看，DSS組表達低于空白組，其差異不具有統計學意義；抗生素清腸+DSS組表達略高于空白組，差異具有統計學意義(P<0.05)。與DSS組相比，DSS+丁酸梭菌組表達高于DSS組，差異具有統計學意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達明顯高于DSS+抗生素清腸組，差異具統計學意義(P<0.001)。從磷酸化IκBα表達情況來看，DSS組和抗生素清腸+DSS組表達明顯高于空白組，其差異均具有統計學意義(P<0.001)。與DSS組相比，DSS+丁酸梭菌組表達低于DSS組，差異均具有統計學意義(P<0.001)。與DSS+抗生素清腸組比較，DSS+抗生素清腸+丁酸梭菌組表達明顯低于DSS+抗生素清腸組，差異具統計學意義(P<0.001)。

圖6 小鼠結腸NF-κB通路表達情況 A：Western blot圖；B：各蛋白相對表達量(*P<0.05，**P<0.01, *** P<0.001)

2.6 緊密連接蛋白與NF-κB通路之間的相關性分析

如圖7所示，將緊密連接蛋白ZO-1和occludin與P65、IκBα及磷酸化的P65、IκBα做相關性分析顯示，ZO-1與IκBα存在正相關，occludin與IκBα、P65存在正相關，其相關性無統計學差異；而ZO-1和occludin與磷酸化的P65(ZO-1：P<0.05；occludin：P<0.01)、IκBα(ZO-1：P<0.01)存在負相關。

圖7 緊密連接蛋白與NF-κB通路相關性分析

3 討論

IBD是一種慢性炎癥性疾病。對IBD的傳統治療主要包括水楊酸制劑藥物、糖皮質激素和免疫抑制劑等，雖然可以控制炎癥、調節免疫以緩解IBD癥狀，但是存在復發率高、緩解率低等缺點。目前，IBD的菌群治療已成為IBD治療十分重要的一部分[12]，而丁酸梭菌屬于益生菌的一種，對IBD的治療也發揮著作用。利用DSS誘導的小鼠腸炎模型是IBD的經典動物模型。本實驗中，DSS組小鼠出現精神萎靡、體質量下降、大便形狀改變、排血便等結腸炎表現；光鏡下見結腸組織出現黏膜結構紊亂、上皮破損和大量免疫細胞浸潤，表明結腸炎模型構建成功。

越來越多的研究表明抗生素清腸準備對于菌群研究和臨床實踐具有重要意義，如偽無菌小鼠模型以及糞菌移植前提倡的抗生素腸道準備[13-14]。本研究發現，丁酸梭菌干預可以改善模型組小鼠體質量下降，降低疾病活動度，并緩解小鼠腸黏膜損傷和免疫細胞浸潤；抗生素清腸預處理后，丁酸梭菌對于體質量、疾病活動度和結腸病理的緩解更顯著。抗生素清腸組小鼠體質量變化不明顯可能與萬古霉素的特殊氣味有關[15-17]。這導致清腸期間小鼠每日飲用水量下降，體質量下降明顯，而恢復正常飲水或含DSS的飲用水后小鼠體質量較前上升或較預期下降不明顯。

腸上皮細胞和黏液組成的腸黏膜屏障是腸道抵抗外來病原菌的第一道防線[18]。在炎癥發生時，病原菌可產生大量促炎因子損傷腸黏膜屏障，繼而誘發擴大全身炎癥反應。而丁酸梭菌具有產丁酸特性，其產生的丁酸為結腸上皮細胞提供能量，并具備抗炎作用[19]。在本實驗中，DSS組小鼠結腸緊密連接蛋白ZO-1、occludin表達明顯降低，而丁酸梭菌干預可有效升高緊密連接蛋白表達，緩解腸黏膜屏障損傷。除此之外，與未使用抗生素清腸組比，使用抗生素清腸后的DSS模型組腸屏障損傷較輕，丁酸梭菌緩解效果更明顯。這表明丁酸梭菌活菌能夠減輕腸黏膜屏障損傷，并在抗生素清腸的情況下發揮更明顯的屏障保護作用。有研究提出抗生素清潔腸道后再進行糞菌移植，可更有利于益生微生物定植于患者腸道，并利用與病原菌的競爭可達到更好的糞菌移植效果[20]。本實驗中，抗生素清腸預處理后丁酸梭菌維持腸屏障作用增強，原因可能為由于抗生素清腸去除了大部分共生菌和條件致病菌，更利于丁酸梭菌的定植和釋放丁酸，從而修復和維持腸上皮屏障。

核轉錄因子NF-κB廣泛存在于真核細胞中，該二聚體由NFKB1(P50)和RelA(P65)這兩個分子組成，常被IκB抑制并以非活化的狀態存在于細胞質[21]。當受到某些促炎因子或脂多糖刺激后，抑制劑IκB將被磷酸化繼而降解，釋放出NF-κB復合體入核，從而發揮調節基因表達和介導炎癥和自身免疫病的作用[22-23]。在AOM/DSS誘導的小鼠炎癌模型中，丁酸梭菌及所產生的短鏈脂肪酸可以有效減低小鼠NF-κB的表達[6, 24]，從而緩解癥狀和調節抗腫瘤免疫。除此之外，在UC患者的結腸黏膜上皮和黏膜固有層可檢測到NF-κB表達增加，眾多促炎因子如IL-6、IL-1β和TNF-α等均可通過增加NF-κB的表達，進而加劇炎癥反應[25]。與以往研究相符，丁酸梭菌可以降低促炎因子TNF-α和IL-1β表達，磷酸化的P65及IκBα的表達同樣被下調；抗生素清腸預處理后，雖然磷酸化IκBα表達在丁酸梭菌組被下調，但是丁酸梭菌下調磷酸化P65表達的效果并不明顯。這個現象說明丁酸梭菌可能通過抑制磷酸化IκBα的表達，恢復IκBα的作用，從而達到抑制NF-κB通路及TNF-α、IL-1β表達、緩解炎癥的效果；而抗生素清腸預處理對磷酸化P65的改變不符合預期，可能因為其加強丁酸梭菌的作用不涉及NF-κB通路，我們還需要進一步的NF-κB入核和定位實驗來確認這一結論。NF-κB的活性形式主要為被磷酸化后由胞漿轉移到胞核，而本實驗檢測到總蛋白未磷酸化NF-κB在模型組中表達略有下調，丁酸梭菌干預后其改變不明顯，可能由于所提取的是整個細胞的總NF-κB，變化無明顯趨勢。此外，在本研究中，緊密連接蛋白表達與NF-κB和IκBα表達存在正相關，而與磷酸化的NF-κB和IκBα表達存在負相關，說明NF-κB通路可能參與黏膜屏障表達調控。但是丁酸梭菌是否通過抑制NF-κB通路進而發揮緩解結腸炎作用，仍需進一步研究證實。

綜上所述，在DSS誘導的小鼠腸炎模型中，丁酸梭菌可以緩解小鼠大體癥狀及修復屏障損傷，其機制可能與NF-κB相關；抗生素清腸預處理可以增加其療效，但對NF-κB通路的影響不大。本文仍存在一些不足：①本研究所闡述的可能機制僅為相關性。對于丁酸梭菌是否通過直接影響NF-κB起作用及作用方式并不明確，仍需要更多的實驗加以闡述；②本研究使用的菌株為單一模式菌株，所展現出的作用對宿主可能具有菌株特異性，若要進行后續研究和應用需明確菌株。總之，本研究探討了丁酸梭菌對于腸炎小鼠粘膜屏障和NF-κB通路的改變，并初步探討了丁酸梭菌發揮抗炎作用的機制，但具體直接作用機制仍待進一步研究。