關(guān)系醬油釀造中谷氨酸生成的谷酰胺酶基因確認(rèn)

伊藤考太郎 小山泰二等

利用基因研究成果，從基因上水平搞清谷酰胺酶。采用計算機模擬（in silico）分析與已知谷酰胺酶相同的基因得知，有4種類型共10個谷酰胺酶基因存在，即在曲菌A.sojaeNBRC4239的基因排列中，與源自Cryptococcus nodaensis耐鹽菌的谷酰胺酶有相同性的Ⅰ型、與有Bacillus subtillis谷酰胺酶活性的谷酰胺轉(zhuǎn)肽酶有相同性的Ⅱ型、與某報告中說系出自A.oyzae谷酰胺酶的gtaA基因有相同性的Ⅲ型，以及與來自Micrococcus luteus的耐鹽性谷酰胺酶有相同性的Ⅳ型。

為了搞清是哪種谷酰胺酶在醬油釀造中發(fā)揮了作用，單獨制作了10個谷酰胺酶基因的破壞菌株，然后檢測各破壞株的谷酰胺酶活性發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型的gahB基因被破壞后，谷酰胺酶的活性降到1/10以下，但用該菌株試釀的醬油其谷氨酸量幾乎未減少。接著，對這10個基因按類型分別進行多次基因破壞，然后將它們組合起來再進行多次基因破壞，最后制作了將所有谷氨酸酶基因全部破壞的菌株。試釀醬油使用了上述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅳ型基因同時被破壞7次，和谷酰胺酶基因全部被破壞的菌株，其酶活已經(jīng)降到1/100以下，所得醬油的谷氨酸含量降低了60%，同時焦谷氨酸含量有所上升，減少的谷氨酸量與推定的由谷酰胺酶反應(yīng)生成的量基本一致。另外，將7個基因進行各種組合并作多處破壞后制成菌株，發(fā)現(xiàn)若將其Ⅰ型gahA、hahB、Ⅱ型gahA和Ⅳ型的gls這4個基因同時破壞則可得到同樣的結(jié)果，搞清了醬油釀造中谷氨酸生成與這4個谷酰胺酶的相互輔佐有關(guān)。

用對上述4個谷酰胺酶進行2～3次基因破壞制成的菌株試釀醬油，結(jié)果雖未看到⊿gahA、⊿ggtA-⊿gls和⊿gahB-⊿ggtA-⊿gls3次基因破壞菌株的谷氨酸含量下降，但觀察到⊿gahA-⊿gahB的2次基因破壞株的谷氨酸生成量下降了20%～30%。將這2個GahA和GahB的蛋白質(zhì)精制，并對各性質(zhì)定性后確認(rèn)，它們不僅是谷酰胺，也是能作用于肽谷酰胺的肽谷酰胺酶，要在醬油釀造中得到高含量的谷氨酸，該酶的反應(yīng)是十分重要的。