微生物谷氨酰胺轉氨酶的來源與生物工程技術研究進展

張秀江，權淑靜，向凌云，劉 麗，解復紅，馮 菲，胡 虹*

（1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省工業酶工程技術研究中心，河南 鄭州 450008）

谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TGase）在動物、植物和微生物的機體組織中廣泛存在，能夠催化肽鏈的谷氨酰胺殘基中的γ-羧酰胺基和?；荏w發生轉?；磻?，促使蛋白質或多肽之間發生共價交聯[1]，改善蛋白質的溶解性、乳化性、彈性、穩定性和凝膠強度，實現不同質地和不同風味的蛋白食品生產[2]。根據來源不同分為兩類，來源于動植物組織的稱為組織谷氨酰胺轉氨酶（tissue transglutaminase，TTGase），來源于微生物發酵制備的稱為微生物谷氨酰胺轉氨酶（microbial transglutaminase，MTGase）。MTGase不需要Ca2+的存在而起作用，分子質量多數在40 kDa左右，在pH 5～9范圍內具有較好的穩定性和較高的酶活性，耐熱的穩定性也較強[3]。MTGase屬胞外酶，微生物發酵過程中可直接分泌到培養物中，酶的分離純化較TTGase更容易。MTGase在食品工業、生物醫藥、化妝品、紡織工業等領域應用前景廣闊，是各種新型蛋白質類制品生產和加工環節一種非常重要的酶制劑[4-5]。MTGase發酵生產具有原料來源廣、成本低、周期短，可以不受環境條件制約進行規模化生產而受到廣泛關注，成為生物酶制劑領域研究和開發的熱點產品。近三十年來，國內外學者在MTGase產酶微生物、MTGase基因、產酶工程菌株構建與表達以及MTGase的分子改造技術等領域進行了大量研究工作，取得了不少進展。本文就MTGase的國內外研究現狀及生物工程領域取得的研究進展進行了綜述，對生物工程技術應用于MTGase的產品生產進行了展望，為高效和低成本MTGase的產品開發及應用提供新的思路和方法。

1 微生物谷氨酰胺轉氨酶的國內外研究現狀

為提高MTGase的產量和酶活，圍繞著產酶微生物菌株的篩選和誘變技術進行了大量研究工作。MTGase最先在茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-1182中分離得到，實現了產品規?；a及商品化應用[3]。隨后研究人員相繼發現鏈輪絲菌屬（Streptoverticillium）和鏈霉菌屬（Streptomyces）的多個菌株都能分泌MTGase，如肉桂鏈輪絲菌（Streptoverticillium cinnamoneu）、拉達卡鏈輪絲菌（Streptoverticillium ladakanum）、吸水鏈霉菌（Streptomyceshygroscopicus）等[6]。DE BARROS L H等[7-8]研究發現，環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）也具備分泌MTGase功能。MTGase菌株商業化開發利用方面，除日本味之素的茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-1182菌株外，還有荷蘭微生物菌保中心的肉桂鏈霉菌（Streptomyces cinnamoneum）CBS683.68菌株、丹麥諾和諾德公司的利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus）NRRLB-3446菌株和扁平鏈霉菌（Streptomyces platensis）DSM40041菌株以及日本大阪發酵研究所的黎巴嫩鏈霉菌（Streptomyces libani）No.13452T菌株等[9-10]。

針對我國MTGase商品化應用一直沒有取得生產性能良好且具有自主知識產權的優良菌株，造成產品生產成本高、價格昂貴、推廣應用困難等技術難題，許多研究者一方面通過直接篩選高表達、高酶活的微生物菌株，另一方面通過微生物菌種誘變技術選育高效產酶菌株。祖海珍等[11]通過N-芐酯基-L-谷氨酰甘氨酸比色法從土壤中分離篩選一株產MTGase灰輪絲鏈輪絲菌（Streptoverticillium griseoverticillatum），酶活達到7 U/mL。段宇珩[12]對茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）K21進行離子束誘變，篩選出產MTGase酶活達3.6 U/mL的S2菌株，菌株的產酶能力提高了56.52%。陳國娟等[13]以灰輪絲鏈輪絲菌（Streptoverticillium griseoverticillatum）ZC03為出發菌株，采用紫外線及氦（He）-氖（Ne）激光復合誘變技術，獲得一株產MTGase性能穩定、酶活顯著提高的ZC60菌株。夏書琴等[14]采用大氣壓輝光放電低溫等離子體誘變技術對茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）03-10進行誘變，選育出產MTGase突變菌株G2-1，酶活達2.73 U/mL，比原菌株提高82%。陳佳[15]采用紫外線和亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）聯合誘變技術結合96孔板篩選技術對茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）進行誘變，選育出2株產MTGase生產性能分別提高45.4%和55.9%的誘變菌株。張瑩等[16]利用紫外-硫酸二乙酯復合誘變技術處理茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis），輔以高通量技術篩選MTGase高產菌株，結果表明經過誘變選育的菌株最高酶活達7.02 U/mL，比原菌株提高54%。郭瑋婷等[17]利用NTG誘變技術結合96孔板高通量篩選方法從茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）中篩選到5株產MTGase耐熱穩定性較高的突變菌株。田淑翠[18]對茂原鏈霉菌（Streptoymy-ces mobaraensis）HS47進行紫外線（ultraviolet，UV）、NTG和常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變，篩選出一株產MTGase酶活為7.7 U/mL的高產菌株，酶活比原始菌株提高了3.08倍。蔣瑩[19]利用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種技術對茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）ECU7480進行多輪迭代誘變，選育的菌株發酵產MTGase酶活比原菌株提高了19%～27%，且經8次傳代仍保持較高的產酶能力。張瑩瑩等[20]從土壤中分離細菌，經過酪蛋白凝膠反應初篩和Folk比色法測定酶活復篩，得到一株產MTGase的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）TGase1318，其所產MTGase耐高溫性能較好。宋佳雯等[21]采用基因組重排技術，通過兩輪基因組重排，輔以96孔板發酵高通量篩選和搖瓶發酵產酶試驗，獲得一株產MTGsae酶活達7.12 U/mL的茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）菌株，產MTGase酶活平均提高65.5%。葉堅[22]用ARTP和UV復合誘變技術對解朊金黃桿菌（Chryseobacterium proteolyticum）PF-Y0360進行誘變，獲得菌株AU-J0789，產MTGase酶活較原菌株提高137%。

2 微生物谷氨酰胺轉氨酶工程菌株的構建和表達

2.1 微生物谷氨酰胺轉氨酶基因

到目前為止，MTGase的微生物編碼基因共有數十種得到了分離和測序，以茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-1182 的基因研究最為系統明確[3]，該基因全長1 249 bp，核苷酸的編碼序列為+20～+1 237的1 218 bp核苷酸序列，共編碼406個氨基酸殘基，半胱氨酸活性位點處于氨基酸序列的64位，因此MTGase應歸屬于蛋白酶類。儀朝印等[23]以茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）為模板，進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），獲得1條993 bp的基因片段，從第46個堿基開始對ATG編碼氨基酸，編碼由316個氨基酸組成的蛋白質。劉松等[24]通過PCR擴增反應得到吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13TGase基因，該基因開放閱讀框共編碼418 個氨基酸（aa），由信號肽（29 aa）、酶原區（57 aa）及TGase（332 aa）組成。在TGase開放閱讀框上游約500 bp有一個啟動子序列，在TGase開放閱讀框下游12 bp處有一個TGase基因轉錄的終止子。張宇[25]研究發現，吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）St4MTG基因編碼長為1 251 bp，第149位氨基酸Cys為活性中心位點，成熟MTGase分子中催化三聯體為Cys149-His359-Asp346。DURAN R等[26]分離了肉桂鏈輪絲菌（Streptoverticillium cinnamoneum）CBS683.68的MTGase基因，蛋白質前體由一條81個氨基酸殘基組成的信號肽和一個330個氨基酸殘基組成的成熟MTGase。王玉等[27]克隆了來自于拉達克輪絲菌（Streptoverticillium ladakanum）B1的MTGase基因，經PCR擴增反應得到MTGase的前導肽（pro）和除前導肽以外成熟的MTGase基因，長度在1 200～2 000 bp。

芽孢桿菌屬（Bacillus）MTGase基因的發現，使得開發不同種類和不同特性的MTGase成為可能。KOBAYASHI K等[28]最早在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中研究發現和克隆了MTGase的基因，但發現MTGase的基因沒有信號肽。張瑩瑩等[20]用PCR方法克隆了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）TGase1318編碼基因tgl，序列長738 bp，編碼由245個氨基酸組成。余小娜[29]從產酶菌株MEPE0134中獲得MTGase基因，用PCR方法擴增出基因tgl序列長750 bp，測序分析表明該基因與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的相似性最高。

2.2 微生物谷氨酰胺轉氨酶工程菌株的構建和表達

由于天然微生物菌株產MTGase能力不強，雖經篩選和誘變技術處理在一定程度上可以提高菌株產酶能力，但很難達到商品化生產的要求，構建基因工程菌株是提高MTGase酶活和產量的有效途徑。日本味之素公司、德國Martin-Luther 大學、臺灣食品工業發展研究所、中國科學院微生物研究所、江南大學、華東師范大學、華東理工大學以及諾和諾德（中國）制藥有限公司等先后開展了MTGase工程菌株構建及表達方面的研究。表達研究涉及MTGase成熟酶和酶原（pro-TGase）的表達以及選擇適宜的宿主、共表達融合酶蛋白、共表達酶原區等。大多數鏈霉菌類和部分芽孢桿菌類MTGase基因已在大腸桿菌、酵母菌、鏈霉菌、芽孢桿菌及棒桿菌等宿主中實現成功表達[24]。

2.2.1 微生物谷氨酰胺轉氨酶工程菌株的構建和表達

WASHIZU K等[30]將茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-8112的MTG產酶基因導入變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）中取得成功表達。KIKUCHI Y等[31]將來源于茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraense）SAMP45基因轉入谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）的細胞內進行表達，該基因還可以對MTGase前體酶原蛋白進行定點改造，最終得到活性較高的MTGase。MARX C K等[32]將來源于茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase酶原（pro-MTG）蛋白在大腸桿菌（Escherichia coli）中進行表達，經乳糖和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）低溫誘導，表達量分別達到65 mg/L和4.5 mg/L，酶活分別達到627 U/g和447 U/g，乳糖誘導的表達量和酶活顯著優于IPTG誘導。NODA S等[33]將肉桂鏈輪絲菌（Streptoverticillium cinnamoneum）的MTGase基因轉入變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）中并成功實現了表達，以木糖作為唯一碳源進行發酵，重組工程菌的MTGase產量達到530 g/L。ITAYA H等[34]將來源于茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase酶原基因在不同的棒桿菌中進行重組，發現多數種類的棒桿菌都能高效表達MTGase。YURIMOTO H等[35]將茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase酶原基因在甲醇酵母中得到成功表達，同時還在變鉛青鏈霉菌（Streptomyce lividans）、大腸桿菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）等宿主中進行表達[36]。

任增亮等[37]在吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）培養液中分離純化得到MTGase的酶原（pro-MTGase），克隆該酶原基因并將其轉入表達載體pET-20b（+）信號肽pelB的下游，獲得重組表達載體pET/pro-MTG。重組表達載體分別在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）和Rosetta（DE3）pLysS中進行表達，低溫條件下誘導，獲得胞外可溶性表達的MTGase酶原，用胰蛋白酶切除酶原前導區域，獲得有活性的MTGase，最高酶活達到0.24 U/mL。劉松等[24]將吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13的TGase基因在變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）TK24進行表達，發酵罐發酵MTGase酶活達到3.2 U/mL，在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中表達，MTGase酶活達到6.8 U/mL。舒暢[38]將茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）來源的MTGase基因及相關突變基因在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達，經過誘導表達、激活酶原、鎳（Ni）柱純化等工藝處理，得到6種重組MTGase，最高表達酶活達到54.62 U/mL。儀朝印等[23]以茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的DNA構建重組質粒pET-22b-MTG，將重組質粒在大腸桿菌（Escherichia coli）中進行表達，MTGase最高酶活達到15.9 U/mL。唐名山[39]從茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraensis）WSH-22中克隆出MTGase基因，在表達載體pQE-30T中構建重組質粒pMTG，將重組質粒pMTG轉化至大腸桿菌（Escherichia coli）M15中，在IPTG誘導下成功表達MTGase，最高表達酶活達到21.3 U/mg。張宇[25]將吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的MTGase基因與大腸桿菌（Escherichia coli）細胞內表達載體pET-23（a）和pET-32（a）連接，構建重組質粒pET-23（a）-MTGase和pET-32（a）-MTGase，轉入大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中進行表達，MTGase酶活表達達到10.23 U/mL。張瑩瑩等[20]用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表達載體pTZ，用大腸桿菌（Escherichia coli）表達載體pET21b，分別構建含基因tgl的重組質粒，轉化為工程菌枯草芽孢桿菌WB800和大腸桿菌（Escherichia coli）BL21，結果表明基因tgl在大腸桿菌中表達MTGase的效果比枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）更好。陸姣姣[40]將茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的基因分別在枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中構建組成型和誘導型MTGase表達載體，并對表達時間、誘導時間和誘導劑濃度等因子進行優化，取得表達MTGase的枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌的工程菌株，表達的MTGase采用激活酶原和Ni柱純化等處理工藝，得到活性更高的MTGase。研究同時表明，激活酶原后的MTGase催化大豆分離蛋白的能力更強。

2.2.2 微生物谷氨酰胺轉氨酶融合蛋白為載體的工程菌構建和表達

YU Y J等[41]從鏈霉菌（Streptomyces netropsis）BCRC 12429中克隆到MTGase（Sn TGase）基因，在大腸桿菌中共表達Sn TGase N 端的前導序列和硫氧還蛋白，重組后MTGase融合蛋白（Trx-proTGase）的表達量為180 mg/L，牛胰蛋白酶處理，MTGase的酶活達到24.9 U/mg。黃柯等[42]從茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）中克隆MTGase基因，構建重組表達載體pGEX-TGase，轉至大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中，構建重組大腸桿菌（Escherichia coli）BL21/pGEX-TGase，重組菌在IPTG誘導條件下產生GST-TGase融合蛋白，實現MTGase融合蛋白的高效表達。邵坤彥等[43]以吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的DNA為模板，采用PCR擴增的方法得到MTGase基因，構建重組質粒pGEXTGase并轉至大腸桿菌（Escherichia coli）中獲得BL21/pGEXTGase重組菌，重組菌通過乳糖誘導產生融合蛋白，采取稀釋及尿素梯度液相色譜相結合的方法處理融合蛋白，實現包涵體融合蛋白復性，經純化處理得到酶活為29 U/mg的MTGase。周建等[44]從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DB403染色體中克隆出MTGase基因，以融合蛋白的形式在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達硫氧還蛋白-MTG融合蛋白，同時發現該融合蛋白也具有MTGase的活性，表明產品在生產過程中可直接添加該融合蛋白，降低MTGase的生產和應用成本。劉凱等[45]以枯草芽孢桿菌DNA擴增獲得帶有SD序列及谷氨酸棒桿菌信號肽ΔS0949的BTG基因，將其與大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達載體pXMJ19連接，構建重組質粒pXMJ19-Sbtg轉至谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032，經IPTG誘導該重組菌可以表達MTGase。

3 微生物谷氨酰胺轉氨酶的分子改造技術

MTGase分子改造主要通過定點突變和隨機突變對MTGase分子結構進行改變。定點突變改變的目標是MTGase活性中心Cys64附近的氨基酸殘基，隨機突變改變的目標是整個MTGase分子結構。目前獲得MTGase高酶活的突變菌株主要是通過對MTGase分子活性中心Cys64附近的氨基酸殘基和其N末端的氨基酸殘基進行生物學改造來實現[46-47]。CHEN K 等[48]通過刪除MTGase分子N末端前4個Asp、Ala、Ala、Asp的氨基酸殘基，促使MTGase的酶活提高32.92%。LIU S等[49]采用TGase或pelB信號肽實現了吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）來源的MTGase在大腸桿菌（Escherichia coli）中以酶原的形式進行表達，將酶原N端切掉，形成具有酶的活性MTGase。SHIMBA N等[50]研究表明，MTGase分子N末端的氨基酸殘基適度缺失或被取代，可提高MTGase的催化活性。ZOTZEL J等[51]在研究MTGase產生過程時發現，鏈霉菌屬（Streptoymyces）來源的MTGase，在機體細胞內先以酶原（pro-TGase）的形式合成，分泌到胞外通過金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶切除N-端酶原區后折疊成為具有活性的MTGase。王坤等[52]通過對茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）MTGase酶原的基因序列密碼子進行改造優化，降低基因中鳥嘌呤（Guanine）和胞嘧啶（Cytosine）的含量，提高其在大腸桿菌（Escherichia coli）中的表達水平，結果MTGase酶原的表達量提高了4.4倍。同時利用融合PCR的定點突變技術將MTGase第二位的絲氨酸改造為脯氨酸，改造后MTGase的酶活提高了1.26倍。任蕊蕊等[53]借助于Discovery Studio 2017軟件分析，確定了茂原鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase與底物α-N-CBZ-GLN-GLY親和力氨基酸位點，通過定點突變處理獲得酶活和催化能力都提高的E300W突變體，突變體表達的MTGase酶活提高31%。

4 微生物谷氨酰胺轉氨酶的生產及應用展望

MTGase具有優良的交聯作用，有助于提高蛋白質的水溶性、起泡性、乳化性和熱穩定性，改善蛋白質產品的外觀、質構和風味，應用前景十分廣闊。產品開發利用方面，酶活的高低對MTGase的應用有重要影響，高效表達酶活的MTGase生產菌株成為目前研究的重點。研究表明，MTGase高產工業化應用菌株可以通過篩選新的MTGase微生物高產菌株、對現有的微生物菌株進行誘變提高其產酶性能、構建MTGase工程菌株和對MTGase 進行分子改造再構建MTGase工程菌株等途徑獲得。構建工程菌株是提高MTGase產量和酶活的有效手段，通過生物工程技術獲得的MTGase菌株產酶性能不易發生衰退，酶活表達水平會更高，可以突破MTGase在天然微生物產酶菌株中酶活表達水平低，造成MTGase生產和應用成本過高的技術難題。因此利用生物工程技術最有希望獲得擁有自主知識產權的MTGase工業化生產應用菌株，滿足食品、生物醫學、化妝品、紡織等領域不斷開發蛋白質類新產品應用需求，促進行業健康快速發展。